测定原理:
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340 nm下测定NADH下降速率,即可反应PFK活性。
自备仪器用品:
离心机、紫外分光光度、水浴锅、1ml石英比色皿、移液枪、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:60ml×1 瓶, 4°C保存
试剂一:40ml×1 瓶,4°C保存
试剂二:粉剂×1 瓶,-20°C保存,临用前加2.8ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-20°C分装保存不能反复冻融
试剂三:粉剂×1 支,4°C保存,临用前加0.26ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-20°C分装保存不能反复冻融
试剂四:液体×1 支,4°C保存,临用前加0.26ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂-20°C分装保存不能反复冻融
样品前处理:
样本提取详见试剂盒内说明书。测定组织和细胞需要测定蛋白浓度。
测定步骤
分别量取:工作液 800μL于测定管1;样本 30μL于测定管2;试剂三 5μL于测定管3;试剂四 5μL于测定管4;
将上述测定管试剂按照从1到4顺序分别加入1ml石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在340nm波长下20秒时的初始吸光度A1和10分20秒时的吸光度A2,计算△A =A1-A2