测定原理:
PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氢离子,苹果酸脱氢酶进一 步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm测定NADH减少速率,从而计算PEPC 活性。
自备仪器用品
台式离心机、紫外分光光度计、1ml石英比色皿、移液枪、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制
提取液 60ml×1瓶, 4°C保存
试剂一 30ml×1瓶,4°C保存
试剂二 10ml×1瓶,4°C保存
试剂三 粉剂×1支,-20°C保存,临用前加8ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂4°C保存一周
试剂四 粉剂×1支,-20°C保存,临用前加5ml蒸馏水充分溶解,用不完的试剂4°C保存一周
试剂五 20μl原液×1支,4°C保存
试剂五 10ml稀释液×1瓶,4°C保存
样品前处理
样本提取详见试剂盒内说明书。测定细菌、组织和细胞时需要测定蛋白浓度。
测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上,调节波长到340nm,用蒸馏水调零。
2、试剂五工作液的配置:将试剂五原液:试剂五稀释液=1:329稀释,用多少配多少。
3、将试剂一、二、三、四和试剂五工作液置于37°C(哺乳动物)或25°C(其他物种)预热5分钟。
4、加样表:
试剂名称(μl) | 测定管 |
试剂一 | 500 |
试剂一 | 150 |
试剂一 | 150 |
试剂一 | 95 |
试剂五工作液 | 95 |
样本 | 20 |
将上述试剂按照顺序加入1ml石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,记录在340nm波长下的初始吸光度A1和5分钟后的吸光度A2,计算△A =A1-A2。