测定原理:
NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素c,还原型细胞色素c在550nm处有独特吸收峰; 通过测定550nm吸光度的增加速率,来计算NCR活性。
需自备的仪器和用品(50T/48样):
可见分光光度计、普通离心机、超速离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿和蒸馏水
试剂的组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,4°C保存;临用前加入100ml 蒸馏水充分溶解。
试剂二:液体×1 瓶,4°C保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20°C保存;临用前加入2.60ml 蒸馏水充分溶解,4°C保存。
试剂四:粉剂×1 瓶,4°C保存;临用前加入550μl 蒸馏水充分溶解,4°C保存。
粗酶液提取:
样本提取详见试剂盒内说明书。测定细菌、组织和细胞时需要测定蛋白浓度。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min 以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零;
2、 试剂二在37°C水浴预热30min以上;
3、 样本测定
(1) 空白管:取1ml玻璃比色皿,一次加入50μl蒸馏水、900μl试剂二、50μl试剂三和10μl试剂四,迅速混匀后于550nm处分别测定第10s吸光值A1和第130s吸光值A2,计算ΔA空白=A2-A1。
(2) 测定管:取1ml玻璃比色皿,一次加入50μl粗酶液、900μl试剂二、50μl试剂三和10μl试剂四,迅速混匀后于550nm处分别测定第10s吸光值A3和第130s吸光值A4;计算ΔA测定=A4-A3。