细胞介绍

注：本培养基是不直接添加氟尿嘧啶药物的。

细胞特性

1)来源：结直肠腺癌

2)形态：上皮样贴壁生长

3)含量：>1x106细胞数

4)规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

(1)1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

(2)T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1)收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2)请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照(10×，20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3)贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4)备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后**次传代建议T25培养瓶1:2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备：

(1)培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

(2)完全培养基的配制：

①准备F12K(推荐iCell-0007) 培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；补充F12K基础培养基至所需体积。

②准备F12K含5-Fu完全培养基：优质胎牛血清，10%；双抗，1%；5-Fu：400～1065uM；补充F12K基础培养基至所需体积。

(3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

注意：

①细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含5-Fu的完全培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含5-Fu的完全培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加5-Fu。

②若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低5-Fu的浓度，或使用不含5-Fu的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-Fu浓度。

细胞培养

(1)细胞复苏

①将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

②准备一支15ml离心管，加入5mL含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；

③戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

④将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；

⑤准备一个T25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mL完全培养基；

⑥离心完成后弃去上清，用1mL完全培养基重悬细胞后，转入T25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

(2)细胞传代

①当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代；

②在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

③向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；

④向瓶内加入消化液1mL(0.25%胰蛋白酶)，浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育3～5min；

⑤孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管；

注意：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

a.准备一个无菌的15mL离心管，加入2mL含10%FBS的完全培养基；

b.将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打)；

c.向之前消化的培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2mL含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。

⑥1000rpm离心5min；

⑦准备两个新的T25培养瓶，各加入4mL完全培养基；

⑧离心完成后，弃上清，用2mL完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T25培养瓶，每个培养瓶各1mL；

⑨水平放置培养瓶，震荡混匀后将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。

(3)细胞冻存(注意：细胞冻存建议每瓶T25冻一支)

①～⑥请参照传代步骤；

⑦离完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8mL冻存管中；

⑧将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

⑨第2天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。记录冻存管位置以便下次拿取。

细胞介绍

HCT-15/FU为由HCT-15细胞构建的耐5-FU药物细胞株。

细胞特性

细胞运输、保存及注意事项

细胞培养试剂的配制

1)5-FU药物的配制及保存

建议将5-FU药物配制成20mg/mL的母液，即使用1mL 1M的NaOH溶液溶解20mg 5-FU药物，使其完全溶解。(若所购买的5-FU药物规格为10mg，则加入0.5mL 1M的NaOH溶液，待其完全溶解即为20mg/mL母液)

注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的5-FU，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

2)冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO，现用现配。(冻存液中不含药物)

3)完全培养基的配制(推荐使用iCell-h073-001b)

细胞培养条件

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%～80%。

细胞处理

1)冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4～6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3～5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6～8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第2天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞生长至汇合度达80%左右时，方可添加10～16ug/mL 5-FU药物；若细胞生长状态较为缓慢，可适当降低5-FU的浓度(**降低一半药物浓度)，或使用不含5-FU的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-FU浓度。

②建议复苏细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩，避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸，造成人员伤害。

2)细胞传代(建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代)

①待细胞密度达到80%～90%时，即可进行传代培养。

②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。

③加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL)，置于37℃培养箱中消化2～5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶至细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。

④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。

⑤向细胞沉淀中加入1～2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6～8mL完全培养基。

注意：细胞传代1～2次后仍能保持增殖，即可提高药物浓度至20ug/mL继续培养；若此过程中细胞停止增殖，且状态较差，则需降低药物浓度(**降低一半药物浓度)或使用不含药物的完全培养基培养，至细胞汇合度约80%，且生长状态较好时，再更换为所需的5-FU药物浓度。

3)细胞冻存

①细胞冻存时，步骤同2)细胞传代的①～④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×106～ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

注意：细胞冻存过程中，不可添加药物。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。