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半胱氨酸(Cys)含量测试盒(微量法)
半胱氨酸(Cys)含量测试盒(微量法)图片
货号:CYS-1-W
包装:100管/96样


产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

蛋白质含有三种含硫氨基酸:甲硫氨酸、胱氨酸和 Cys。其中,Cys 是**一种含有巯基的含硫氨基酸,从甲硫氨酸转化而来,并且可与胱氨酸互相转化。Cys 参与蛋白质二硫键的形成,经常是蛋白质活性中心的组成部分,还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外,Cys 大量积聚在皮肤和粘膜表面,在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性,并且补充巯基,以维持皮肤的正常代谢,调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。

测定原理:

Cys 还原磷钨酸生成钨蓝,在 600nm 处有吸收峰;通过 600nm 吸光度,计算 Cys 含量。

自备仪器和用品:

低温离心机、可调式移液枪、酶标仪、96 孔板、85%磷酸和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。用前 1 天,向试剂三中加 0.5mL 蒸馏水充分溶解,再加 85% 磷酸 0.125mL,混匀后盖紧(防止水分散失)沸水浴 2h;冷却后加 2mL 蒸馏水,4℃可保存2 周。

标准品:粉剂×1 瓶,临用前加 10 mL 蒸馏水,充分溶解。1μmol/mL 标准液,4℃避光保存。 用不完的试剂 4℃可保存 3 天。

半胱氨酸提取:

1、 液体样品中半胱氨酸提取:取 0.1mL 液体样品,加试剂一 0.9mL,充分混匀,8000g 4℃离心 10min,取上清液,待测。

2、 组织中半胱氨酸提取:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10 min,取上清液待测。

3、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定操作:

1.酶标仪预热 30 min,调节波长到 600 nm。

2. 空白管:取 96 孔板,加入 20μL 蒸馏水,160μL 试剂二,20μL 试剂三,混匀后室温静置15 min,于 600nm 处测定吸光值,记为 A 空白管。

3. 标准管:取 96 孔板,加入 20μL 标准液,160μL 试剂二,20μL 试剂三,混匀后室温静置15 min,于 600nm 处测定吸光值,记为 A 标准管。

4. 测定管:取 96 孔板,加入 20μL 上清液,160μL 试剂二,20μL 试剂三,混匀后室温静置15 min,于 600nm 处测定吸光值,记为 A 测定管。

注意:空白管和标准管只需要做一次。

计算公式:

1.  按液体样品的体积计算:

半胱氨酸含量(μmol/mL)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×(V 样总÷V样)=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)

2.  按质量计算:

半胱氨酸含量(μmol/g  鲜重)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A空白管)]×(V 样总÷V 样)÷W=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

3.  按照蛋白浓度计算:

半胱氨酸含量(μmol/mg prot)= [C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]÷(V 样×Cpr)=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

4.  按细胞数量计算:

氨基酸含量(μmol/104 cell)=[C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)] ×(V 样总÷V 样×细胞数量)=1×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)÷细胞数量

C 标准品:标准品浓度,1 μmol/mL;V 标准品:反应体系中加入标准品体积,0.02mL;V 样:反应体系中加入样品提取液体积,0.02  mL;V 样总:样品提取液,1mL;W:样品质量,g。

注意事项:

最低检出限为 100μmol/L。

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