注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理：

酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在 680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算 ACP活性。

自备仪器和样品：

水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、0.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配置：

液体一：2mL×1支，4℃保存。

液体二：1mL×1支，4℃保存。

试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水=90(μL)：20(μL)：21(mL)的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 4mL蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入 10mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 20mL蒸馏水溶解。试剂五：液体 4mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体 1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、试剂一的配制：见试剂的组成和配制。

2、组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL试剂一)冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

3、血清或培养液：直接测定。

4、细菌、真菌：按照细胞数量(10⁴个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。

3.对照管：取 0.5 mL EP管，加入 20μL粗酶液，40μL试剂二，混匀后置于 30℃水浴保温10min；加入 40μL试剂三，混匀后 8000g，4℃离心 10min；取 40μL上清液，加入新的 EP管，再加入 200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，680nm测定光吸收，记为 A对照管。

4.测定管：取 0.5 mL EP管，加入 20μL粗酶液，40μL试剂三，混匀后置于 30℃水浴保温10min；加入 40μL试剂二，混匀后 8000g，4℃离心 10min；取 40μL上清液，加入新的 EP管，再加入 200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A测定管。(注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二)

5.空白管：取 0.5 mL EP管，加入 40μL蒸馏水，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A空白管。

6.标准管：取 0.5 mL EP管，加入 40μL标准品，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温 20min，取 200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于 680nm测定光吸收，记为 A标准管。

ACP活性计算公式：

1.按照样本蛋白浓度计算

ACP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)÷Cpr

2．按照样本质量计算

ACP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)×V反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)÷W

3.按照液体体积计算

ACP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)

1.按照细胞数量计算

ACP活性单位定义：30℃每 10⁴个细胞每分钟催化水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/104  cell)=C标准品×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T=  125×(A测定管－A对照管)÷(A标准管－A空白管)÷细胞数量

C标准品：0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)；V1：加入反应体系中粗酶液体积(mL)，0.02  mL；V2：提取液总体积(mL)，1mL；T：催化反应时间(min)，10min；W：样品质量(g)。

注意事项：

1.试剂一按操作指示配制，用多少配多少，出现白色絮状沉淀则不能用。

2.临用前配制的试剂配置好后 3天内使用完毕。