注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B₁(Vitamin B₁)是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB₁在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与 Fe³⁺在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在 704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 70mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体 2mL×1支，4℃保存。

试剂三：液体 2mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 5mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：液体 3mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

1.组织：将样品磨碎，按照质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入 0.6mL提取液)加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心 10min，取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min)。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议  500万细胞加入 0.6mL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

3.血清：直接测定。

测定操作

计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R² = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A(A测定管-A空白管)

1.按照蛋白含量计算

VB₁含量(μg/mg prot)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷Cpr= 58.8×(△A-0.0031)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₁含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(W÷V样总)= 58.8×(△A-0.0031)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₁含量(μg/10⁴ cell)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(细胞数量÷V样总)= 58.8×(△A-0.0031)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₁含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.017= 58.8×(△A-0.0031)

V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0085x +0.0031，R² = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A(A测定管-A空白管)

1.按照蛋白含量计算

VB₁含量(μg/mg prot)=(△A -0.0031)÷ 0.0085÷Cpr= 117.65×(△A-0.0031)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₁含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031))÷ 0.0085÷(W÷V样总)= 117.65×(△A-0.0031)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₁含量(μg/10⁴ cell)=(△A-0.0031)÷ 0.0085÷(细胞数量÷V样总)= 117.65×(△A-0.0031)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₁含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.0085= 117.65×(△A-0.0031)

V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1.若测定结果中吸光值超过 2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色完成后立即进行测定。

4.标准曲线线性范围为 0.1-10μg/mL。