正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称 NADH-CoQ还原酶或 NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中***蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH传递给 CoQ，同时可使 O₂还原生成 O₂^-，是呼吸电子传递链上产生 O₂^-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态，而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。

测定原理

复合体Ⅰ能够催化 NADH脱氢生成 NAD+，在 340nm下测定 NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。需自备的仪器和用品紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：液体 100ml×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20ml×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5ml×1瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 25ml×1瓶，-20℃保存；

试剂五：液体 1ml×1支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入 2ml蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①准确称取 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1ml试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10秒，重复 30次)，用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、200μL工作液和 15μL试剂六，混匀，记录 340nm处初始吸光值 A₁和 2min后的吸光值 A₂，计算 ΔA=A₁-A₂。

复合体Ⅰ活力单位的计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

(1)按蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鲜重 ) =[ΔA×V反总÷ ( ε×d )×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=365×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.73×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.25×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml； T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下：

(1)按蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鲜重 ) =[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×10⁹]÷(W×  V样÷V样总 )

÷T=730×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.46×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.25×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。