正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ICL(EC₄.1.3.1)主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH在 LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在 340nm下有特征吸收峰，监测 340nm吸光度的减小速率可间接反应 ICL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 50ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体 15ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5ml蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍-20℃保存；

试剂四：粉剂×3瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5ml蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体 800μL×2支，4℃保存；临用前每支加入 560μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍 4℃保存；

试剂六：粉剂×3瓶，4℃保存；临用前每瓶加入 5ml蒸馏水，充分混匀待用。用不完的试剂-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：

将上述试剂按顺序加入 1 ml玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，在 340nm波长下记录 20秒时的初始吸光度 A₁和 2分 20秒时的吸光度 A₂，计算 ΔA=A₁-A₂。注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液，在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min以上，测定时加入 1220μL混合液和 300μL试剂六测定。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=2443×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=2443×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=4.886×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.52×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。