注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入2.5ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体4ml×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体15ml×1瓶，4℃保存。

标准液：液体1ml×1支，4℃保存，5μmol/ml对硝基苯酚溶液。

产品说明：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)，15000g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml。

二、测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂)：

充分混匀， 400nm处测定吸光值A。△A=A测定管-A对照管

根据标准管的吸光度(x：各标准管吸光值减去浓度为零的标准管的吸光值)和浓度(y，nmol/ml)建立标准曲线，将△A带入标准曲线中，计算样品生成的产物量(nmol/ml)。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(nmol/h/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=14×y÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(nmol/h/g鲜重)＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=14×y÷W

(3)按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(nmol/h/10⁴ cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.028×y

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；V反总：反应体系总体积，0.07ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，0.5h。