淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用。

2.试剂二：临用前加入35ml蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解。

3.标准品：10mg无水葡萄糖。临用前加入1ml蒸馏水配制成10mg/ml的标准溶液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

称取约0.1g样本，加入0.8ml蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10ml，摇匀，即淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1ml，加入4ml双蒸水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。

二、测定步驟

1.分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2.将10mg/ml葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml的标准溶液。

3.取2支EP管分别加入250μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴5min，分别作为α-淀粉酶对照管和β-淀粉酶对照管使用。

4.按操作表依次加入各试剂：

混匀，沸水浴10min，在540nm下测定吸光度，从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5和A6，计算ΔAα=A2-A1，ΔA总=A4-A3，ΔA标准=A6-A5。

三、酶活性计算

1.标准曲线的绘制：以ΔA标准为y轴，以标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将ΔAα测定带入方程得到x1(U/ml)，ΔA总代入方程得到x2(mg/ml)。

(1)按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x1÷Cpr

(1)按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性 (U/g质量)=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=10×x2÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T=x2÷Cpr

4. β-淀粉酶活性计算：

(1)按照样本质量计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W)=(10×x2-2×x1)÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(x2÷Cpr)-(0.2×x1÷Cpr)

5：总淀粉酶稀释倍数，(4ml+1ml)/1ml=5；V样：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V样总：提取液总体积，10ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

注意事项：

测定的吸光值大于1时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。