细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

产品组成：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100ml蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加入1ml无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉×1管，4℃保存。临用前加入0.5ml蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水4ml充分溶解。

试剂六：液体×1瓶，室温保存。

试剂七：液×1瓶，4℃保存。

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mlEP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。

需自备的仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1.除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。

2.粗制微粒体：4℃，100000g，离心60min，弃上清液。

3.除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1ml试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g离心30min，弃上清液。

4.最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5ml，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

二、AND 活性测定步骤：

1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。

2.试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3.对照管：取 1支 EP管，加入 10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置于 37℃水浴保温30min；立即加入 35μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL试剂六，混匀后室温静置 5min；室温8000rpm离心 5min；取新的 EP管，加入 100μL上清液，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm测定光吸收，记为 A对照管。

4.测定管：取 1支 EP管，加入 10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置于 37℃水浴保温30min；立即加入 35μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μL试剂六，混匀后室温静置 5min；室温8000rpm离心 5min；取 1支新 EP管，加入 100μL上清液，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却5min，于 412nm测定光吸收，记为 A测定管。

5.标准管：取 1支 EP管，加入 100μL标准品，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm测定光吸收，记为 A标准管。注意：每个样品都需要做对照管。

三、AND 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T=45×(A测定管－A对照管)÷A标准管÷Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管－A对照管)÷A标准管÷W。

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=0.0001 L；稀释倍数：V反总÷V上清液=(10+170+10+10+35+35)÷100=2.7； Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/ml)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒； V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01ml；V样总：提取液体积，0.5ml；W：样本质量，g；T：催化反应时间(min)，30min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T=45×(A测定管－A对照管)÷ A标准管÷ Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管－A对照管)÷ A标准管÷W。

C标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=0.0001 L；稀释倍数：V反总÷V上清液=(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7； Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/ml)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒； V样：加入粗酶液体积，10μL=0.01ml；V样总：提取液体积，0.5ml； W：样本质量，g  ； T：催化反应时间(min)，30min。

注意事项：

1.粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分装后，-80℃保存；

2.试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用 1周；

3.粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA法测蛋白含量。