果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bispHospHate aldolase，FBA)(EC 4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶，催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛，广泛存在于动植物及微生物体内，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。

果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

2.试剂三：临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3.试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

4.试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入2ml蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。

操作步骤 (仅供参考) ：

一、样品处理理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

①总 FBA酶：

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液一)充分冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细菌或细胞：按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液一)，冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。液体：直接检测。

②胞浆和叶绿体 FBA酶的分离：

(1)按照植物组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5-10的比例(建议称取约 0.1g样本，加入 1ml提取液一)，手工快速研磨或匀浆，之后于 4℃，200g离心 5min；

(2)弃沉淀，取上清在 4℃，8000g离心 10min(离心时缓慢加速和降速)；

(3)取上清用于测定胞浆 FBA酶活性，取沉淀加 1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)，然后 4℃，8000g离心 10min，上清即为叶绿体中 FBA酶活性。

建议测定总 FBA 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA，则按照步骤②提取粗酶液。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2.样本测定：(在微量石英比色皿/96孔 UV板中分别加入下列试剂)。

注意：如果检测样本量大，可以将试剂一、二、三、四、五按照 5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)。

三、FBA 含量计算

A、按微量石英比色皿计算：

(1)按蛋白浓度计算

酶活单位定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活单位定义：每 g组织每分消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞或细菌数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/10⁴cell)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个)

(4)按液体体积计算

酶活单位定义：每 ml液体每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

FBA酶活(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×10⁹×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.1ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。

注意事项：

1.若ΔA大于 0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.若是植物样本，建议在提取完成后 2h内检测完，如果样本量过大，建议分批提取、检测。

3.由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(约 0.5mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量。