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硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测试剂盒(微量法)
硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装:50管/48样


产品介绍

TrxR是一种NADpH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及NADpH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似,催化GSSG还原生成GSH,是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

TrxR催化NADpH还原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412nm有特征吸收峰,但还原型谷胱甘肽与DTNB同样能反应生成TNB,因此本试剂盒利用2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽,通过测定412nm波长处 TNB的增加速率,即可计算TrxR活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
试剂一液体120ml×1瓶2-8℃
试剂二液体3ml×1瓶2-8℃
试剂三粉剂×2支-20℃
试剂四液体30μL×1瓶-20℃

溶液的配制:

1.试剂三:临用前取1支加入1.667ml蒸馏水溶解,用不完的试剂-20℃保存1周。

2.试剂四:临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释10倍后使用。

需自备的仪器和用品:

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(ml)为  1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml试剂一)进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待检测。

2.细菌、细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min),然后10000rpm,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。注:测定前将上清液与试剂四以50:1的体积比混匀(即取100μL上清液加入2μL试剂四混合)37℃水浴30min后至冰上。

二、测定操作

1.分光光度计或酶标仪预热30min后,调节波长到412nm,用蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)预热30min。

3.空白管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL试剂二,20μL试剂三,160μL试剂一,迅速混匀后于412nm测定10s时的吸光度,37℃水浴5min迅速拿出测量412nm下的吸光度记为A1和A2。计算ΔA空白管=A2-A1。

4.测定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL试剂二,20μL试剂三,140μL试剂一,20μL上清液,迅速混匀后于412nm测定10s时的吸光度,37℃水浴5min迅速拿出测量412nm下的吸光度,记为A3和A4。ΔA测定管=A4-A3。

三、TrxR活性计算

a.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/mg prot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T=147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每克样本每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×109×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/104cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×109×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε:TNB在412nm处的摩尔消光系数,1.36×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/ml),需要另外测定;W:样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;细胞数量:以104为单位,万个;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

b.用96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/mg prot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T=245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每克样本每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×109×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:在25℃或者37℃中,每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/104 cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×109×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε:TNB在412nm处的摩尔消光系数,1.36 ×104L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/ml),需要另外测定;W :样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02ml;V样总:提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;细胞数量:以104为单位,万个;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

注意事项:

1.哺乳动物组织及血液制品TrxR活力测定时,一般须用蒸馏水稀释5倍左右;测定过程操作须迅速。

2.由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约0.1mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

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