产品及特点

节菱孢霉菌(Arthrinium spp.)简称节菱孢或节菱孢菌，是一类产毒霉菌，有 20多个种，其中使甘蔗变质并产生有神经毒素的节菱孢霉菌主要是甘蔗节菱孢菌(Arthrinium sachari)、暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum)和蔗生节菱孢菌(Arthrinium saccharicola)。其产生的毒素为 3-硝基丙酸，是一种耐热性水溶性有毒物质，主要损害中枢神经系统。从某种意义上讲，有甘蔗存在，就有节菱孢菌威胁人体健康的潜在危险存在，因此快速检测节菱孢霉属具有重要意义。荧光定量 PCR是检测病原的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测节菱孢霉属的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供 DNA模板。

2、特异性高，引物是根据节菱孢霉属高度保守区设计,不扩增其他微生物。

3、引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR高 100倍。

4、提供无传染性的 PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5、一管式操作，荧光 PCR检测，不容易产生环境污染。

6、本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50次 20μL体系的染料法荧光定量PCR。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45  μL荧光 PCR专用模板稀释液。

3、在 7号管中加入 5  μL阳性对照(其浓度为 1×10⁸拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5  μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5  μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8、如果有 N个样品，则需要进行 N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 PCR模板，省略了 DNA提取步骤。

三、设置 qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果进行定量分析，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6个标准曲线样品只选一个做(可以选 4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

注:仅 ABI7500、7700和 7900仪器需要使用 ROX作为对照，其他荧光 PCR仪器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene  3000、RotorGene  6000和 LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR(可以根据仪器不同而自行优化)。四、荧光定量 PCR反应参数

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以  Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。