产品及特点

呼肠孤病毒是具分节段的双链 RNA基因组的一类病毒，分布广，病毒粒呈球形，大小在 60-80纳米之间的 20面体结构。本产品是基于染料法荧光定量 PCR原理开发，专门检测牛呼肠孤病毒的试剂盒。它具有下列特点：

1、一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据牛呼肠孤病毒基因组的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、基于染料法 qRT-PCR检测，灵敏度比常规 RT-PCR高 10-100倍。

4、使用一管式 qRT-PCR技术，RT和 PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5、本产品足够 50次 20μL体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为  12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供核酸片段作为阳性对照。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照(以 10E1-10⁶这 6个 10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1、 1.标记 6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。用带芯枪头分别加入 45μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

2、在 6号管中加入 5 μL  1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3、换枪头，在 5号管中加入 5 μL  1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4、换枪头，在 4号管中加入 5 μL  1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA的制备

5、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4号(浓度为 1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于 10万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒  RNAout。

三、设置 RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，1个用于 PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6个标曲反应缩减成 1个，其余不变。

8、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子关闭盖子后最后添加)：

注:个别qPCR仪器型号需要添加ROX染料校正，以消除管之间的光程差使其保持一致以使实验达到更准确的数据。

需使用  ROX染料 I的机型：ABI  Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus，建议终浓度500nM。

需使用  ROX染料  II的机型：： ABI  Prism  7500 、7500Fast 、MJ   Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000，建议终浓度50nM。

9、上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。

四、数据处理

10、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品  RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

11、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于32。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于30。对待测样品，如果其Ct≥32则为阴性，如果≤30则为阳性。如果在30-32之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果≥32则为阴性，如果小于32，则为阳性 。熔解曲线也须一并考虑，如果熔解 Tm值与目的扩增片段 Tm值相差≥2℃，则为非特异性扩增，不是真正的阳性扩增。