| 包装 | 价格(元) |
| 25 rxns | 电议 |
| 50 rxns | 电议 |
| 100 rxns | 电议 |
Hyper Assembly Cloning Kit用于将一个或多个目标DNA片段简便、高效、快速地定向克隆到任何载体的任何位点。该方法利用超组装酶的3'-5'核酸外切酶活性，在PCR产生的插入片段和线性化载体的末端获得15-20nt的互补区，然后融合DNA片段以获得重组载体，仅需室温反应3min即可进行转化，完成定向克隆。15-20-bp的重叠区可以通过设计用于扩增目标序列的引物来引入。Hyper Assembly Cloning Kit具有以下特点：
o将任何目的片段克隆到您选择的任何载体的任何位置
o可高效克隆50 bp-10 kb片段
o在单个反应中将多个DNA片段同时克隆到任何载体中
o无需限制性消化，磷酸酶处理或连接步骤
| Component | Size | Volume | Storage |
5X Hyper Assembly Enzyme Mix | 25 rxns | 12.5 μL | Store at -20°C |
| 50 rxns | 25 μL | ||
| 100 rxns | 50 μL | ||
| DpnI | 20,000 units/ml | 5 μl |
1. 载体处理及引物设计？
a. 载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切、反向PCR，优先选择双酶切。
b. 引物三部分：同源臂(15bp - 20bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40% - 60%)+ 酶切位点(根据实验需求保留或者删除) + 特异性引物(引物Tm值的计算不包括同源臂的序列)。
2. 平板上未长出克隆或克隆数目很少。
a.引物设计不正确：引物包含15 bp-20 bp同源臂(不计算酶切位点)，GC含量40%-60%。
b.线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系。
c.载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA使用体积不应超过4μL(反应体系体积的1/5)；建议线性化载体、PCR产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在pH 8.0的ddH2O中。
d.感受态细胞效率低：感受态细胞的转化效率需大于107 cfu/μg。可进行简单检测，转化1 ng质粒，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算转化效率为107 cfu/μg；重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/6，否则会降低转化效率；选择克隆用感受态细胞(如DH5α/XL10)，不能选择表达感受态细胞。
3. 在负对照平板上长满很多菌落（几百个）
表明载体没有完全线性化：
a.你应该用DpnI酶消化处理PCR产生的线性化载体，以去除非线性化的模板；
b.如果线性化载体是酶切反应得到的，应该充分酶切（比如延长酶切时间），再将酶切产物切胶回收。
4. 多数克隆不含插入片段或含有不正确的插入片段。
a.PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
b.克隆载体线性化不完全：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物。
c.反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，如扩增产物未纯化直接用于重组反应时推荐Dpn I消化，或者对扩增产物进行胶回收纯化。
5. 菌落PCR无条带。
a.引物不正确：推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
b.PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
重组失败：只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
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