抑制活性

将含有复制子的Huh7.5细胞胰蛋白酶化，并以40,000个细胞/孔接种在48孔板中。第二天更换培养基，并将VX-222以七种不同浓度加入细胞中，其中每对在200 μl完全培养基中以3-或10倍进行稀释，一式三份。48小时后，使用TRIzol试剂从复制子细胞提取总RNA，并通过实时逆转录PCR（RT-PCR）定量病毒RNA。用1g总RNA和Moloney鼠白血病病毒和4 M随机9-核苷酸（nt）引物混合物合成第一链cDNA。使用Bio-Rad IQ SYBR green试剂盒进行RT-PCR，引物是HCV 5'-UTRsense（5'-AGC CAT GGC GTT AGT ATG AGT GTC-3'）和5'-UTRanti（5'-ACA AGG CCT TTC GCG ACC CAA C-3'）。使用正义和反义寡核苷酸5'-GAGTCAACGGATTTGGTC GT-3'和5'-TGG GAT TTC CAT TGA TGA CA-3'分别检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。将所有反应混合物95℃加热10分钟，然后进行40个PCR循环，95℃ 15秒，55℃ 20秒，72℃ 30秒。将每组的倍数变化和百分比变化与对照进行比较。使用GraphPad Prism软件通过具有对数曲线拟合的非线性回归分析计算使HCV RNA复制子水平降低50％（EC50）的有效VX-222浓度。

细胞系

HCV基因型1b（HCV-1b）mADE复制子细胞。

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度大于10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月

反应条件

1 μM，6天

实验结果

在HCV复制子细胞中，VX-222以剂量依赖性方式将IFN-β启动子活性增加5.0倍，抑制HCV活性的EC50和EC90值分别为0.3和12 nM。此外，由于抑制病毒复制，VX-222恢复了Sendai病毒激活的Rig-1途径。

患者

基因型1丙型肝炎病毒感染的患者

剂量

100或400 mg每日两次，VX-222+特拉匹韦（'DUAL'方案），加上利巴韦林（'TRIPLE'方案）或聚乙二醇干扰素+利巴韦林（'QUAD'方案）；12周。

实验结果

VX-222（100或400 mg每日两次）具有良好耐受性。TRIPLE（VX-222 400 mg每日两次）和QUAD（VX-222 100和400mg每日两次）的患者的持续病毒学应答分别为67％、79％和90％。

注意事项

请测试所有化合物在室内的溶解度，实际溶解度和理论值可能略有不同。这是由实验系统的误差引起的，属于正常现象。

References:

[1]. Yi G, Deval J, Fan B, et al. Biochemical study of the comparative inhibition of hepatitis C virus RNA polymerase by VX-222 and filibuvir. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(2): 830-837.

[2]. Kalkeri G, Lin C, Gopilan J, et al. Restoration of the activated Rig-I pathway in hepatitis C virus (HCV) replicon cells by HCV protease, polymerase, and NS5A inhibitors in vitro at clinically relevant concentrations. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(9): 4417-4426.

[3]. Di Bisceglie AM, Sulkowski M, Gane E, et al. VX-222, a non-nucleoside NS5B polymerase inhibitor, in telaprevir-based regimens for genotype 1 hepatitis C virus infection. Eur J GastroenterolHepatol, 2014, 26(7): 761-773.