1、引 言

    磺胺(Sulfonamides，SAs)是一类广谱抗菌药物，广泛应用于水产养殖业和畜牧业，是预防和治疗细菌感染性疾病的化学药物。磺胺类药物还用于马、牛的传染性脑膜炎，羊下痢、猪下痢和弓形体病，并且对于禽类球虫病具有较好疗效。由于养殖业中磺胺类药物的使用导致了动物源性食物中残留，从而危害人体健康。我国和欧盟均规定了磺胺在动物组织中的最高残留限量。动物组织中磺胺的检测方法主要有液相色谱串联质谱法，液相色谱紫外检测法，液相色谱荧光检测法。磺胺类药物自身不具有荧光活性，采用荧光检测法时通常需要进行柱前或柱后化学试剂衍生才能进行检测。研究发现，磺酰胺基是光化学活性基团，在紫外光照射下会发生光化学反应，产物具有荧光性质，通过荧光光度法可以对其进行检测。最近研制出一种光化学在线衍生器，应用于高效液相色谱后，可以进行在线光化学衍生使分子产生荧光活性，利用荧光检测器可以有效地检测。相比于柱前或柱后化学试剂衍生法，光化学衍生不需要额外的衍生化试剂，也不需要柱后衍生反应的试剂泵，减少了人工操作，同时也避免衍生化过程中人为操作因素带来的误差。光化学衍生不引入其他杂质，减少了人体与有毒试剂的接触和曝露，更加绿色、环保、简便、快捷。到目前为止，关于光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法在磺胺类药物检测上的应用尚未见报道。本实验系统研究了光化学衍生的实验条件，建立了简便，可靠，灵敏度高的动物组织中磺胺药物残留的检测方法。

    2、实验部分

    2.1 仪器与试剂 

    Agilent 1260高效液相色谱仪配荧光检测器(美国Agilent公司)；光化学衍生器(由紫外灯(11W)、聚四氟乙烯反应管(25m × 0.25mm)组成，北京华安麦科公司)；高速匀浆机(德国IKA公司)；高速离心机(美国Thermo公司产品)；旋转蒸发仪(德国IKA公司)；氮气吹干仪(天津市恒奥科技有限公司)；涡旋混合器(太仓市华利达实验设备有限公司)。

    甲醇、乙腈(色谱级，德国Merck公司)；甲酸、正己烷(色谱级，美国TEDIA公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。

    标准物质：磺胺嘧啶(纯度≥99.5%)，磺胺噻唑(纯度≥99.5%)，磺胺甲基嘧啶(纯度≥99.2%)，磺胺吡啶(纯度≥99.0%)，磺胺二甲基嘧啶(纯度≥99.0%)，磺胺对甲氧嘧啶(纯度≥98.0%)，磺胺氯哒嗪(纯度≥99.0%)，磺胺甲氧哒嗪(纯度≥99.2%)，磺胺二甲异噁唑(纯度≥98.0%)，磺胺苯甲酰(纯度≥99.0%)，磺胺喹噁啉(纯度≥98.0% )。标准物质均购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

    标准溶液的配制：分别准确称取10.0mg上述标准品于10.0mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.0g/L的储备液，于-18℃储存。分别吸取1.0g/L的标准溶液50μL于10.0mL容量瓶中，用甲醇定容，配成5.0mg/L混合标准溶液，用时用流动相稀释成一系列浓度的标准溶液。

    2.2 色谱条件

    Eclipse Plus C18液相色谱柱(250mm × 4.6mm，5.0μm； Agilent公司)；柱温：35℃；进样量50μL；流动相A为甲醇，B为乙腈，C为水(均含0.2%(V/V)乙酸)，梯度洗脱：0.0～12.0min，10% A，5% B，85% C；12.0～28.0min，10% A，5%～32% B，85%～58% C；30.00～33.00min，10% A，32% B，58% C；33.00～33.10min，10% A，32%～5% B，58%～85% C。流速1.0mL/min。光化学衍生器紫外灯照射波长254nm，照射时间为1min。荧光检测器：激发波长248nm，发射波长350nm；激发波长248nm，发射波长412nm。

    2.3 样品前处理

    称取肉样5.0g(精确到0.01g)于50.0mL离心管中，加入5g无水Na2SO4，20mL乙腈，用高速匀浆机以12,000r/min匀浆2min，以8,000r/min离心10min，上清液转移至100mL烧瓶中，残留物用20mL乙腈重复提取一次，合并上清液。用旋转蒸发器在40℃，17kPa负压下蒸至近干，用氮气吹干残余液，加入1.0mL流动相和1.0mL正己烷充分溶解，转移至2.0mL离心管中，以8,000r/min离心10min，弃去上层正己烷，再次加入0.5mL正己烷涡旋2.0min，以8,000r/min离心10min，弃去上层正己烷，下层清液过0.22μm滤膜，滤液供HPLC分析。

    3、结果与讨论

    3.1 在线光化学衍生反应

    磺胺类药物自身无荧光特性，不能采用荧光检测器直接进行检测。磺酰胺基是光化学活性基团，在紫外光照射下会发生光化学反应，光化学反应的产物可能为4,4'-二氨基二苯酚、苯胺和对氨基苯磺酸的混合产物，产物具有荧光性质。因此可以在柱后加装光化学衍生器，对磺胺药物进行在线光化学衍生化，然后采用荧光检测器进行检测。磺胺经过紫外光诱导后化学键发生变化产生的荧光性，其强度受分子结构的影响较大。因为不同的取代基团对光化学反应的影响不同，所以不同取代基的磺胺药物的荧光强度也不一样，激发波长和发射波长也存在着差异，这一点与柱前或柱后化学试剂衍生不同。常规的柱前或柱后化学试剂衍生一般是使目标物衍生化上一个荧光基团，其检测的激发波长和发射波长一般是该荧光基团的激发波长和发射波长。将磺胺类药物标准溶液在线光化学衍生化后进行荧光光谱扫描，各磺胺药物的最佳激发波长在235～260nm之间，最佳发射波长在320～450nm之间，综合考虑，确定磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲异噁唑和磺胺苯甲酰的激发波长为248nm，发射波长为350nm；磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的激发波长为248nm，发射波长为412nm。 

    11种磺胺药物的标准色谱峰经光化学衍生器衍生前后的效果比较见图1。11种磺胺药物的标准溶液在光化学衍生器未开启时，各磺胺药物几乎没有荧光响应信号(图1A) ；光化学衍生器开启后，荧光大幅增强(图1B)。

    3.2 高效液相色谱条件的优化

    参考磺胺检测的相关文献，使用甲醇、乙腈、乙酸溶液三相作为流动相，对比了甲醇、乙腈为有机相与含不同浓度的乙酸溶液组成的流动相对磺胺药物分离的影响。实验发现，不含酸的流动相，磺胺的药物的色谱峰形出现拖尾，部分组分重叠。加入乙酸后，色谱峰形对称，分离效果好。考察了不同浓度乙酸对色谱峰形的影响，发现0.2%乙酸既能保证较好的分离效果，同时也不影响色谱柱的使用寿命。由于乙腈的洗脱能力较强，磺胺药物在色谱柱上的保留时间短，部分磺胺分离度较差，甲醇的洗脱能力较弱，分离度好，但是磺胺药物的保留时间较长，且峰型较扁平。采用合适的甲醇、乙腈、乙酸可得到较好的分离度和较快的分离效率。优化后的色谱分离条件见2.2节，11种磺胺的标准色谱图见图1。

图1 光化学反应前(A)后(B)11种磺胺的高效液相色谱图

Fig.1 HPLC chromatograms of 11 sulfonamides before (A) and after (B) on-line photochemical derivatization 1: Sulfadiazine, 2: Sulfathiazole, 3: Sulfamerazine, 4: Sulfapyridine, 5: Sulfachloropyridazine, 6: Sulfadoxine, 7: Sulfamethoxy-pyridazine, 8: Sulfameter, 9: Sulfisoxazole, 10: Sulfabenzamide,11: Sulfaquinoxaline.

    3.3 前处理方法的建立

    比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果。甲醇的提取效率较低，也不易沉淀蛋白。乙酸乙酯提取有利于下一步的处理，但是提取物的脂肪含量较高，除脂过程很容易损失目标物。乙腈的提取效率较高，而且提取液的脂肪含量较少，处理也相对方便。乙腈提取液带入的少量脂肪可以用正己烷去除，尽量减少基质的干扰，图2为净化后空白样品和加标样品的色谱图。

图2 11种磺胺空白样品(A)和加标样品(B)的高效液相色谱图

Fig.2 HPLC chromatograms of 11 sulfonamides for blank sample (A) and spiked sample (B) 1: Sulfadiazine, 2: Sulfathiazole, 3: Sulfamerazine, 4: Sulfapyridine, 5: Sulfachloropyridazine, 6: Sulfadoxine, 7: Sulfamethoxy-pyridazine, 8: Sulfameter, 9: Sulfisoxazole, 10: Sulfabenzamide, 11: Sulfaquinoxaline.

    3.4 线性范围，检出限和定量限

    采用空白基质液配制系列浓度的标准溶液，以各分析物的峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，磺胺类药物在10～500μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，各分析物的相关系数R²>0.999。以3倍信噪比(S/N = 3)计算方法的检出限，以10倍信噪比(S/N = 10)计算方法的定量限，其中磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的检出限和定量限分别为0.2和0.5μg/kg；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺苯甲酰的检出限和定量限分别为1和3μg/kg；磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲异噁唑的检出限和定量限为3和10μg/kg，详见表1。

表 1  11种磺胺的回归方程、相关系数(R2)、检出限和定量限

Table 1  Regression equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of 11 sulfonamides

磺胺   Sulfonamides		回归方程   Regression equation	相关系数 R2	检出限 LOD* (μg/kg)	定量限 LOQ* (μg/kg)
	R
磺胺嘧啶 Sulfadiazine		y = 2017.62x - 61.89	0.9994	1	3
磺胺噻唑 Sulfathiazole		y = 1897.70x + 20.56	0.9995	1	3
磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine		y = 1402.33x - 41.72	0.9994	3	10
磺胺吡啶 Sulfapyridine		y = 11361.75x - 37.15	0.9992	1	3
磺胺氯哒嗪Sulfachloropyridazine		y = 8944.63x - 5.74	0.9998	1	3
磺胺二甲基嘧啶 Sulfadoxine		y = 2200.70x - 50.48	0.9991	3	10
磺胺甲氧嗪 Sulfamethoxypyridazine		y = 4744.01x - 65.01	0.999	1	3
磺胺对甲氧嘧啶 Sulfameter		y = 15699.15x - 18.27	0.9998	0.2	0.5
磺胺二甲基异噁唑 Sulfisoxazole		y = 1456.02x - 29.74	0.9992	3	10
磺胺苯甲酰 Sulfabenzamide		y = 2991.64x + 9.14	0.9994	1	3
磺胺喹噁啉 Sulfaquinoxaline		y = 12776.23x + 1.98	0.9995	0.2	0.5

* LOD: limit of detection, LOQ: limit of quantification.

    3.5 回收率和精密度

    对阴性猪肉样品进行回收率实验，添加水平分别为定量限的3倍和5倍，采用优化后的前处理方法对样品进行处理，每个添加水平重复6次，各磺胺的平均回收率在85.7%～101.1%之间，RSD为1.9%～6.6%，详见表2。

表 2 猪肉中11种磺胺的加标回收率结果(n = 6)

Table 2  Recoveries for the 11 sulfonamides in pork (n = 6)

    3.6 实际样品测定

    利用本方法测定了购于农贸市场的10个猪肉样品中的磺胺类药物残留量。在10个样品中，仅有1例样品检出磺胺二甲嘧啶，测得量为24.5μg/kg(n=3)。结果表明，本方法相比于常规化学试剂衍生检测法具有绿色、环保、灵敏度高、稳定性好的优点，适用于肌肉组织中磺胺药物残留的检测。