检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA原理。

预包被： 特异性抗大鼠HSP27抗体已预先包被在微孔板上。

加样与结合： 将标准品、质控品、待测样本加入微孔中。样本中的大鼠HSP27会与包被抗体结合。

洗涤： 洗去未结合的物质。

加检测抗体： 加入生物素标记的另一种特异性抗大鼠HSP27抗体（检测抗体），该抗体能与已结合的HSP27上的不同表位结合，形成“包被抗体-HSP27-生物素化检测抗体”复合物。

洗涤： 再次洗去未结合的检测抗体。

加酶结合物： 加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的链霉亲和素 (Streptavidin)。链霉亲和素会与生物素特异性结合。

洗涤： 洗去未结合的酶结合物。

显色： 加入底物溶液 (TMB - 3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。HRP催化无色的TMB转化为蓝色产物。

终止反应： 加入终止液 (通常是酸性溶液)，使反应停止，颜色由蓝变黄。

读数： 在450nm波长处（以630nm或570nm作为参比波长）用酶标仪测定各孔的吸光度 (OD值)。

定量： 以标准品的浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样本的OD值，通过标准曲线计算其HSP27的浓度。

试剂盒主要组分

预包被微孔板： 96孔（或根据需要48孔）可拆酶标板，包被有大鼠HSP27捕获抗体。

大鼠HSP27标准品 (Lyophilized or Liquid)： 通常为重组大鼠HSP27蛋白，提供已知浓度梯度（例如：0 ng/mL, 15.625 ng/mL, 31.25 ng/mL, 62.5 ng/mL, 125 ng/mL, 250 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL）。需严格按照说明书稀释或复溶。

生物素标记的检测抗体 (Concentrated)： 特异性结合大鼠HSP27的检测抗体，需按照说明书比例稀释。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 (SABC, Concentrated)： 需按照说明书比例稀释。

样本稀释液： 用于稀释血清、血浆等样本。

20X / 30X 洗涤缓冲液 (Concentrated)： 需用蒸馏水或去离子水稀释后用于洗涤微孔板。

TMB 底物溶液： 显色底物，避光保存。

终止液： 通常是稀硫酸 (1M 或 2M) 或盐酸溶液。具腐蚀性，小心操作。

封板膜： 用于孵育期间覆盖板孔。

样本前处理

血清/血浆： 使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂采集全血，离心分离出血清/血浆。避免反复冻融。严重溶血的样本可能影响结果。

细胞裂解液： 使用合适的细胞裂解缓冲液裂解细胞，离心去除细胞碎片，取上清检测。蛋白浓度过高时需用样本稀释液进行适当稀释。

组织匀浆液： 将组织剪碎，用预冷的PBS或裂解缓冲液匀浆，离心去除不溶物，取上清检测。蛋白浓度过高时需稀释。

其他体液： 可能需要特定的处理方法或稀释，请参考说明书建议。

操作步骤

准备： 将所有组分和样本平衡至室温（约20-25°C）。配制好所需工作浓度的洗涤液、标准品、检测抗体、酶结合物。准备好微孔板。

加样： 设置空白孔（只加样本稀释液或缓冲液）、标准品孔（不同浓度梯度）、待测样本孔。向相应孔中加入100μL处理好的标准品或样本。（注意：避免产生气泡）。

孵育1： 盖上封板膜，37°C 孵育 90-120 分钟（具体时间见说明书）。

洗涤： 弃去孔内液体，用洗涤液充满各孔（约300μL），静置30秒-1分钟，弃去，在吸水纸上拍干。重复此过程3-5次。

加检测抗体： 每孔加入100μL稀释好的生物素化检测抗体。

孵育2： 盖上封板膜，37°C 孵育 60 分钟。

洗涤： 同步骤4，洗涤3-5次。

加酶结合物： 每孔加入100μL稀释好的SABC工作液。

孵育3： 盖上封板膜，37°C 孵育 30 分钟。

洗涤： 同步骤4，洗涤5次，确保洗涤彻底。

显色： 每孔加入90-100μL TMB底物溶液，避光，室温（或37°C）孵育15-30分钟（或按说明书时间，观察显色情况）。

终止： 每孔加入50μL终止液。轻轻混匀（颜色由蓝变黄）。

读数： 在加入终止液后30分钟内，用酶标仪在450nm波长处读取吸光度（OD值）。建议使用双波长检测（如450nm/630nm 或 450nm/570nm）以消除孔板或溶液浑浊造成的背景干扰。

结果计算

计算每个标准品孔和样本孔的平均OD值（减去空白孔OD值，如果空白值较高）。

以标准品浓度为X轴（通常取对数），对应的平均OD值为Y轴，绘制标准曲线（使用四参数或对数-对数曲线拟合效果通常较好）。

根据样本孔的OD值，在标准曲线上查找对应的浓度值。

如果样本经过稀释，计算出的浓度需乘以相应的稀释倍数。

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