大鼠核因子κB(NF-κB)ELISA试剂盒

检测原理

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。预先包被抗大鼠NF-κB抗体的微孔板中依次加入样本、标准品及HRP标记的检测抗体，经温育洗涤后，通过TMB底物显色（蓝色→黄色），颜色的深浅与样本中NF-κB浓度呈正相关。最终在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算浓度。

样本处理

血清：采集后需静置30分钟，3000g离心10分钟，避免溶血或反复冻融。

血浆：建议使用EDTA或肝素抗凝，3000g离心30分钟取上清。

组织匀浆：按质量体积比1:9加入PBS匀浆，离心后取上清。

保存：短期（24小时）可置于4℃；长期需分装存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。

操作步骤

试剂准备

使用前将所有组分平衡至室温（20-30分钟）。

标准品溶解：加入1mL稀释液复溶，静置10分钟后梯度稀释（建议7-8个浓度点）。

加样与孵育

标准品孔：依次加入不同浓度标准品50μL。

样本孔：加入待测样本50μL（需做复孔）。

空白孔：仅加稀释液。

覆膜后37℃孵育60-90分钟。

洗涤

弃去孔内液体，每孔加洗涤液300μL，浸泡30秒后弃去，重复3-5次，最后拍干。

显色与终止

每孔加入TMB底物100μL，避光反应15-30分钟（显蓝色）。

加入终止液50μL，颜色转为黄色后30分钟内测定OD值。

结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线（推荐四参数拟合）。

根据样本OD值从曲线中推算浓度，若样本稀释需乘以稀释倍数。

注意事项

实验前需核对试剂盒组分，避免漏项或污染。

加样时需更换枪头，避免交叉污染。

显色时间需严格控制，避免过度反应影响准确性。

若样本浓度超出标准曲线范围，建议稀释后重新检测。

性能参数

检测范围：通常为15.6-1000 pg/mL（具体以实际标准曲线为准）。

灵敏度：≤5 pg/mL。

批内/批间变异系数：<10%和<15%。
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