检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。预先在微孔板内包被抗人PKA单克隆抗体。加入样本或标准品，其中的人PKA会被板内抗体捕获。洗涤去除未结合物质后，加入生物素标记的抗人PKA抗体 (检测抗体)，该抗体会与已捕获的PKA结合。再次洗涤后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶 (Streptavidin-HRP) 结合物，其会与检测抗体上的生物素结合。最后加入四甲基联苯胺 (TMB) 底物溶液，在HRP催化下产生蓝色产物。加入终止液终止反应，蓝色变为黄色。在450 nm波长下测量吸光度 (OD值)。样品中的PKA浓度与OD值成正比，通过与标准曲线比较即可计算出样品中PKA的浓度。

试剂盒组分

| 组分 | 规格 (96T) | 预装状态 | 保存条件 (未开封) |

| 1. 预包被抗人PKA抗体的微孔板 (Anti-PKA McAb Pre-coated Plate) | 1块 (8孔×12条) | 真空密封干燥 | 2-8°C |

| 2. 人PKA标准品 (PKA Standard) | 2瓶 | 冻干粉或液体 | 详见标签。通常：冻干粉2-8°C；液体复溶前2-8°C，复溶后按说明书分装 -20°C保存 |

| 3. 标准品&样品稀释液 (Standard & Sample Diluent) | 1瓶 (15/20 mL) | 液体 | 2-8°C |

| 4. 生物素标记的抗人PKA抗体 (Biotinylated Anti-PKA Antibody) | 1瓶 (100/120 µL) | 浓缩液体 | -20°C 避光 |

| 5. 生物素抗体稀释液 (Biotinylated Antibody Diluent) | 1瓶 (10/15 mL) | 液体 | 2-8°C |

| 6. HRP标记的链霉亲和素 (Streptavidin-HRP Conjugate) | 1瓶 (100/120 µL) | 浓缩液体 | -20°C 避光 |

| 7. 酶结合物稀释液 (HRP Conjugate Diluent) | 1瓶 (10/15 mL) | 液体 | 2-8°C |

| 8. 浓缩洗涤液 (Wash Buffer Concentrate (20-25X)) | 1瓶 (20/30 mL) | 浓缩液体 | 2-8°C |

| 9. TMB底物溶液 (TMB Substrate Solution) | 1瓶 (10/12 mL) | 液体 | 2-8°C 避光 |

| 10. 终止液 (Stop Solution) | 1瓶 (10/12 mL) | 液体 (通常为1M或2M H₂SO₄) | 2-8°C |

| 11. 封板膜 (Plate Sealer) | 3张 | -- | 室温 |

| 12. 说明书 (Instructions for Use) | 1份 | -- | 室温 |

样本处理

血清： 血液凝固后，室温(20-25°C) 1500-2000×g离心10分钟。收集上清(血清)，避免溶血。立即检测或分装冻存于 -20°C 或 -80°C (避免反复冻融)。

血浆： 使用合适的抗凝剂(如EDTA、肝素、柠檬酸盐)收集。采血后30分钟内，于2-8°C 1000-2000×g离心15分钟。收集上清(血浆)，立即检测或分装冻存于 -20°C 或 -80°C (避免反复冻融)。

细胞裂解液：

收集细胞，用冷PBS洗涤2次后沉淀细胞。

加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冷RIPA裂解液或其他合适裂解缓冲液 (避免裂解缓冲液中含有干扰HRP活性的组分如NaN₃)。

冰上裂解15-30分钟。

4°C, 12000-14000×g离心10-15分钟。

收集上清(细胞裂解液)。立即检测或分装冻存于 -20°C 或 -80°C (避免反复冻融)。上样前需测定总蛋白浓度 (如BCA法)，上样时建议使用稀释液将蛋白浓度调整在合理范围内 (参考试剂盒说明书建议)，或提供相同背景的空白裂解液作为稀释对照。

组织匀浆液：

取适量组织块，于冷PBS中漂洗，滤纸吸干。

将组织剪碎成小片，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冷RIPA裂解液或其他合适缓冲液。

冰上用匀浆器研磨成匀浆。

4°C, 12000-14000×g离心10-15分钟。

收集上清(组织匀匀浆上清)。立即检测或分装冻存于 -20°C 或 -80°C (避免反复冻融)。上样前需测定总蛋白浓度，并参照细胞裂解液说明进行调整或空白对照。

结果计算

计算标准品和样本复孔的平均OD值 (减去空白孔OD值或参考波长OD值，如果需要)。

以标准品浓度为横坐标 (X轴，对数坐标或线性坐标，通常对数为好)，平均OD值（扣除空白后）为纵坐标 (Y轴)，在坐标纸上绘制标准曲线（建议使用四参数或双对数曲线拟合软件进行拟合）。

注意事项

安全**： 终止液 (H₂SO₄) 具有强腐蚀性！操作时务必穿戴实验服、手套和护目镜，避免接触皮肤和眼睛。其他试剂成分应作为潜在生物有害物质处理，废弃物按规定分类处理。

试剂储存： 严格按照说明书要求储存各组分。冷冻保存的组分避免反复冻融（建议**开启时按每次使用量分装）。未使用的板条应连同干燥剂放回原袋密封，储于2-8°C。

试剂配制： 所有稀释必须按说明书指定的稀释液和稀释倍数精确配制。混匀充分。工作稀释液在实验当天配制。

温育条件： 温育温度和时间必须严格控制。使用提前预热的恒温箱。温育时盖上封板膜防止蒸发。

洗涤过程： 洗涤是减少非特异吸附的关键！务必加足量洗涤液 (保证充满孔底)。浸泡足够时间 (让抗体-抗原复合物结合力弱的非特异性物质充分解离)。充分拍干 (避免残留液体稀释后续试剂，但避免过度干燥使板吸附蛋白变性)。严格完成指定洗涤次数。

加样操作： 加样时枪头勿触及孔壁和孔内液面，避免交叉污染。推荐使用多道移液器提高效率。加样顺序保持一致。

加样体积： 准确加入100 µL (或其他指定体积) 的样本和试剂。

显色控制： TMB显色为动态过程，颜色深浅和温育时间密切相关。需在相同显色时间内读取所有孔结果。避免过度显色（标准曲线高浓度OD接近酶标仪上限如>3.0）或显色不足（低浓度OD值过低）。显色应避光。

混匀： 显色前试剂加样后可轻轻震荡板架混匀。终止液加入后必须充分混合。

立即读数： 终止后颜色稳定性有限，需在规定时间内 (5-30分钟) 完成读数。

复孔检测： 为保证结果的可靠性和可重复性，强烈建议所有标准品和样本都进行至少双复孔检测。

样本质量： 溶血、脂血或反复冻融的样本可能影响结果。使用高速离心去除沉淀杂质。细胞/组织裂解液要新鲜制备或妥善保存，

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