产品用途

本试剂盒用于定量检测人血清、血浆、细胞裂解液、组织匀浆液或其他相关生物液体中蛋白激酶 B (PKB/Akt) 的总蛋白含量 (通常检测pAkt或其他泛Akt抗体识别的表位)。

仅供体外研究使用 (For Research Use Only, RUO)。不可用于诊断。

原理

(以夹心法为例)：

微孔板 (Microplate) 预先包被有抗人PKB/Akt的单克隆抗体 (Capture Antibody)。

将标准品 (Standards)、质控品 (Controls) 和样品 (Samples) 加入孔中，样本中的人PKB/Akt会被孔内的捕获抗体结合。

洗板 (Wash) 去除未结合物质。

加入生物素标记的抗人PKB/Akt检测抗体 (Biotinylated Detection Antibody)，该抗体会与已被捕获的人PKB/Akt结合。

洗板去除未结合的检测抗体。

加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 (Streptavidin-HRP)，它会与生物素结合。

洗板去除未结合的Streptavidin-HRP。

加入底物溶液 (TMB Substrate Solution)。HRP催化底物反应，产生蓝色产物，加入终止液 (Stop Solution) 后变成黄色。

在特定波长下（通常是450nm，参考波长570nm或630nm）测量每孔的吸光度 (OD)。

样品的OD值与样品中人PKB/Akt的浓度成正比，通过绘制标准曲线即可计算出样品中的人PKB/Akt浓度。

样本收集与处理

血清： 全血室温放置30min-2h凝固后，1000-3000×g离心15-20min，吸取血清。避免溶血、脂血。-20°C或-80°C冻存。避免反复冻融。

血浆： 使用合适的抗凝剂（如EDTA，肝素，枸橼酸钠）。采集后30min内1000-3000×g离心15-20min，吸取血浆。-20°C或-80°C冻存。避免反复冻融。

细胞裂解液： 使用含蛋白酶抑制剂（和磷酸酶抑制剂，若检测磷酸化形式）的适当裂解液裂解细胞，充分离心（如12000×g, 5min, 4°C），取上清。蛋白浓度需要测定（如BCA法）以进行后续等量上样或浓度校正。-80°C冻存更佳。

组织匀浆： 组织剪碎，加入裂解液在冰浴中匀浆，充分离心取上清。测定蛋白浓度。-80°C冻存更佳。

稀释： 根据说明书推荐或预实验结果，使用试剂盒提供的样品稀释液对样品进行适当稀释。确保稀释后样本浓度处于标准曲线范围内。

操作步骤

准备：取出试剂盒平衡至室温 (约30min)。配置所有试剂（标准品、洗涤液等）。

加样：在微孔板相应孔中加入标准品、质控品、稀释好的样品（100μL/孔是常见体积）。设空白孔（只加样品稀释液或底物终止液）。

孵育：盖上封板膜，室温或37°C避光孵育 X 分钟（如1-2小时）。

洗板：孵育结束，弃去孔内液体。每孔加入洗涤工作液，浸泡 Y 秒（如30-60秒），弃液，拍干。重复此步骤 Z 次（如3-5次）。

加检测抗体：每孔加入配置好的生物素化检测抗体工作液（如100μL）。

孵育与洗板：同上（步骤3&4），孵育时间（如1小时），洗板。

加酶结合物：每孔加入配置好的 Streptavidin-HRP 工作液（如100μL）。

孵育与洗板：同上（步骤3&4），孵育时间通常较短（如30分钟），洗板。

加底物：每孔加入底物溶液（如90-100μL），避光室温孵育 T 分钟（如15-30分钟）。显色时间需优化，避免过强饱和。

终止：每孔迅速加入终止液（如50-100μL）。此时溶液由蓝变黄。轻震混匀。

读板：30分钟内（越快越好）用酶标仪测定各孔在 450 nm 处的吸光度值（OD450）。使用双波长校正时，在570nm或630nm测吸光度值并从OD450中减去。空白孔调零。

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