人百日咳毒素(PT)ELISA试剂盒

核心特性

检测原理：采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被人百日咳毒素多克隆抗体的透明酶标包被板中，温育后洗涤，再加入酶标工作液温育洗涤，然后依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人百日咳毒素浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，计算样本中人百日咳毒素含量。

检测样本类型：血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆等生物液体，不能检测含NaN₃的样品，因NaN₃抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

特异性：可检测天然或重组的百日咳毒素，与其他相关蛋白无明显交叉反应。

试剂盒组成

组分 数量 用途

酶标包被板 1块（96孔） 预包被人百日咳毒素多克隆抗体

标准品（冻干） 1瓶 用于绘制标准曲线，定量样本浓度

生物素标记抗体 1瓶 特异性结合目标抗原

酶标试剂（HRP标记） 1瓶 催化底物显色

底物溶液（TMB） 1瓶 显色反应底物（需避光保存）

浓洗涤液 1瓶 洗涤未结合物质，需稀释使用

终止液（2N H₂SO₄） 1瓶 终止酶促反应，使颜色稳定

样本稀释液 1瓶 稀释样本及标准品

操作要点

样本处理：

血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

血浆：根据标本要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。

细胞培养上清：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。

组织标本：切割标本后称取重量，加入一定量的PBS（pH7.4），用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后保持2-8℃温度，加入PBS匀浆充分，分装后一份待检测，其余冷冻备用。

标本采集后尽早提取，提取后尽快实验，若不能马上试验，可放于-20℃保存，避免反复冻融。

实验流程

标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，按特定方式进行稀释，稀释后各孔加样量为50μl，浓度分别为30IU/L、20IU/L、10IU/L、5IU/L、2.5IU/L。

加样：设空白孔、待测样品孔，在待测样品孔中先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍），将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

温育：操作同上述温育步骤。

洗涤：操作同上述洗涤步骤。

显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差，一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请乘以总稀释倍数(×n×5)。
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