人表皮角蛋白(EK)ELISA试剂盒

检测原理

采用双抗体夹心法（Sandwich ELISA）：

预包被抗人EK单克隆抗体于微孔板；

加入样本/标准品，与抗体结合；

加入生物素标记检测抗体，形成“抗体-抗原-检测抗体”复合物；

加入辣根过氧化物酶（HRP）标记链霉亲和素；

加入TMB底物显色，显色强度与样本中EK浓度成正比。

检测范围

15.6–1000 pg/mL

（高灵敏度版本可达1.56 pg/mL）

样本类型

适用样本：

血清、血浆（肝素/EDTA抗凝）

细胞培养上清液

组织裂解液（需离心去沉淀）

样本处理要求：

血清/血浆：避免反复冻融，2–8°C可保存1周，-20°C长期保存；

组织样本：推荐用RIPA裂解液提取蛋白。

试剂盒组分（96孔装）

| 组分 | 规格 | 数量 |

| 预包被微孔板 | 8孔×12条 | 1板 |

| EK标准品（冻干粉） | 10 ng/mL | 2支 |

| 生物素标记检测抗体 | 1:100稀释 | 120 μL |

| HRP-链霉亲和素 | 1:100稀释 | 120 μL |

| TMB显色液 | 避光 | 10 mL |

| 终止液（2M H₂SO₄） | - | 10 mL |

| 洗涤缓冲液（20×浓缩液） | - | 30 mL |

| 样本稀释液 | - | 10 mL |

| 封板膜 | - | 4张 |

操作步骤

准备：将标准品用样本稀释液梯度稀释（1000/500/250/125/62.5/31.2/15.6 pg/mL）。

加样：

每孔加入100 μL标准品/样本，37°C孵育90分钟。

洗涤：弃液体，洗板3次（350 μL/孔洗涤液）。

加检测抗体：每孔加100 μL生物素标记抗体，37°C孵育60分钟。

加酶结合物：洗涤后，加100 μL HRP-链霉亲和素，37°C孵育30分钟。

显色：洗涤后，加90 μL TMB，避光显色15分钟（蓝色）。

终止与读数：加50 μL终止液（变黄色），450 nm波长测OD值（参考630 nm）。

结果计算

绘制标准曲线（浓度 vs. OD值，Log-Log拟合）；

根据样本OD值计算EK浓度。

注意事项

关键质控点

标准曲线R²需≥0.99，否则需重测；

复孔CV值应＜15%；

空白孔OD值＜0.15。

性能参数

| 指标 | 数据 |

| 检测灵敏度 | 5.1 pg/mL |

| 板内精密度 | CV < 8% |

| 板间精密度 | CV < 10% |

| 特异性 | 无交叉反应（人Collagen I/III, Cytokeratin 5等） |

| 回收率 | 85%-115% |
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