预期用途

用于体外定量检测人血清、血浆(EDTA/肝素)、细胞培养上清液或其他生物液体样本中的人多肽YY(PYY)浓度。

检测方法: 夹心法酶联免疫吸附测定(双抗体夹心ELISA)

检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。预先在酶标板微孔中包被了抗人多肽YY单克隆抗体。加入待测样本或标准品后，其中的PYY会与包被抗体结合。洗板后，加入生物素标记的抗人多肽YY抗体(检测抗体)，形成固相抗体-抗原-生物素化抗体复合物。再次洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)。最后加入底物溶液(TMB)，在HRP催化下产生蓝色产物，加入终止液后变为黄色。颜色的深浅与样本中PYY的浓度成正比。在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样本中PYY的含量。

主要组成成分

预包被酶标板: 1块 (96孔)，包被抗人多肽YY抗体。

人多肽YY标准品冻干粉: 1瓶或数瓶。通常有不同浓度梯度(例如: 0, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000 pg/mL 或类似范围)。使用前需按要求用样本稀释液溶解并稀释至规定体积。

生物素化抗人多肽YY抗体 (浓缩液): 1瓶。使用前需用生物素化抗体稀释液按说明书比例稀释。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素 (Streptavidin-HRP) (浓缩液): 1瓶。使用前需用Streptavidin-HRP稀释液按说明书比例稀释。

10× 洗涤缓冲液 (浓缩液): 1瓶。使用前需用去离子水或蒸馏水按1:9或1:10比例稀释成工作液。

样本稀释液 (Assay Diluent): 1瓶。用于稀释标准品和可能的样本。

生物素化抗体稀释液 / Streptavidin-HRP稀释液: 各1瓶 (也可能合用)。

TMB底物溶液 (显色液): 1瓶。

终止液 (Stop Solution): 1瓶 (通常为2M H2SO4)。

封板膜 (Plate Sealer): 数张。

产品说明书: 1份。

样本收集与处理

血清: 采集后室温凝固30分钟，1000×g离心15分钟，收集上清液。立即检测或分装后于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

血浆: 推荐使用EDTA或肝素抗凝管。采集后30分钟内1000×g离心15分钟，收集血浆上清。立即检测或分装后于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

细胞培养上清: 离心去除细胞碎片，收集上清。立即检测或分装冷冻保存。

其他液体: 处理方法参照以上原则，确保澄清、无沉淀。

注意:

标本溶血或脂血可能影响结果。

样本收集后应尽快处理并检测，长期保存于推荐温度。

避免反复冻融超过3次。

检测前如样本浓度过高超出标准曲线范围，请使用样本稀释液进行适当稀释，计算时需乘以相应的稀释倍数。

操作步骤

确定布局: 在酶标板架上固定好板条。规划好标准品孔、待测样本孔、空白孔位置。通常设置复孔。

加样: (每步加样后轻微晃动板子混匀，可封板膜覆盖)

空白孔： 加100μL 样本稀释液。

标准品孔： 依次加入100μL各浓度标准品(S1-S8)。

待测样本孔： 加入100μL已处理好或适当稀释的待测样本。

温育: 用封板膜封板，放入37℃恒温孵育箱中，孵育90分钟或说明书指定时间。

洗板: 小心揭开封板膜，弃去孔内液体。

手动洗板: 每孔加满洗涤工作液，静置30秒，弃去，重复4次（或按说明书次数）。最后一次洗完后，在吸水纸上用力拍干。

洗板机洗板: 设置清洗次数为4-5次（按说明书），确保充分洗涤和拍干。洗涤彻底是关键！

加生物素化抗体: 每孔加入100μL准备好的生物素化抗体工作液 (空白孔除外)。

温育: 封板膜封板，放入37℃孵育箱中，孵育60分钟或说明书指定时间。

洗板: 同步骤4，再洗涤4-5次并拍干。

加Streptavidin-HRP: 每孔加入100μL准备好的Streptavidin-HRP工作液 。

温育: 封板膜封板，放入37℃孵育箱中，避光孵育30分钟或说明书指定时间。

洗板: 同步骤4，再洗涤4-5次并拍干。

加底物(TMB): 每孔加入90μL (或100μL) TMB底物溶液，避光室温放置(可放孵育箱避光孵育) 15-25分钟或观察颜色变化 (当最高浓度标准品孔出现明显蓝色梯度且较低浓度也可见时)。

终止反应: 每孔加入50μL (或100μL) 终止液，轻轻晃动板子使混合均匀。此时溶液由蓝色变为黄色。

读数: 立即(在15分钟内)使用酶标仪在450nm波长下读取各孔的OD值（主波长450nm）。若酶标仪具备双波长功能，同时读取参考波长（如540nm, 570nm或630nm）用于扣除非特异性吸收。

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