预期用途

本试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、细胞培养上清液或组织匀浆等生物样本中天然和重组人二氢嘧啶酶样2 (DPYSL2) 蛋白的浓度。

检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附测定 (Sandwich ELISA) 原理。

预包被： 在微孔板上预先包被了抗人DPYSL2的单克隆抗体（作为捕获抗体）。

加样孵育： 样本或标准品被加入孔中，其中含有的DPYSL2蛋白会被捕获抗体特异性结合。

洗涤： 洗去未结合的杂质。

加检测抗体孵育： 加入生物素标记的抗人DPYSL2抗体（检测抗体），该抗体能与被捕获的DPYSL2蛋白的另一表位结合，形成“抗体-抗原-抗体”复合物。

再次洗涤： 洗去未结合的检测抗体。

加链霉亲和素-HRP孵育： 加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）。链霉亲和素会与检测抗体上的生物素高亲和力结合。

最终洗涤： 彻底洗去未结合的酶复合物。

显色： 加入显色底物TMB（四甲基联苯胺）。在HRP的催化下，TMB转化为蓝色产物。

终止反应： 加入终止液（酸性溶液）使反应停止，颜色由蓝转黄。

读值： 在450nm波长（参比波长570nm或630nm用于背景校正）下用酶标仪测定各孔的吸光度值（OD值）。OD值与样本中DPYSL2的浓度成正比。通过绘制标准曲线即可计算出样本中DPYSL2的浓度。

样本要求

样本类型： 人血清、EDTA或肝素抗凝血浆、细胞培养上清液、[可能适用的组织匀浆液]。

采集与处理：

全血：尽快分离血清/血浆（室温血液凝固30分钟或4°C过夜凝血后离心；抗凝血直接离心）。

离心：推荐 4°C, 1000-3000 x g 离心15-20分钟，取上清。

细胞培养上清：离心去除细胞碎片。

组织：称重后加入适量预冷的PBS（建议含蛋白酶抑制剂），机械匀浆或超声破碎，离心取上清。

储存： 短期内可 2-8°C 保存（< 24小时），否则应分装冻存于 -20°C 或 -80°C。避免反复冻融。样本中DPYSL2在冻融一次后通常较稳定，但仍建议尽量减少冻融次数。

稀释： 在正式实验前，可能需要对样本进行适当倍数的稀释（使用标准品/样本稀释液），具体稀释倍数需通过预实验确定，使样本浓度落在标准曲线的**检测范围内（通常是中部区段）。

操作步骤

准备： 将所有组分和样本平衡至室温（约30分钟）。配制所有需要稀释的缓冲液和试剂（如20X洗涤液按1:20稀释成工作液）。标准品按说明书要求梯度稀释。

加样： 在相应孔中加入 100 μL 的标准品、稀释过的样本或对照品（每孔建议做复孔或三重复孔）。覆上封板膜。

孵育1： 37°C 恒温孵育 [通常90分钟或根据实际说明]。

洗板： 弃去孔内液体，每孔加满洗涤液（300-350μL），静置30秒后弃去，在吸水纸上拍干。重复此步骤3-5次（按实际说明）。

加检测抗体： 每孔加入 100 μL 生物素标记检测抗体工作液。覆上封板膜。37°C 恒温孵育 [通常60分钟]。

洗板： 同步骤4。洗板3-5次。

加SA-HRP： 每孔加入 100 μL SA-HRP工作液。覆上封板膜。37°C 恒温孵育 [通常30分钟]。

洗板： 同步骤4。洗板3-5次。

显色： 每孔加入 90 μL 混合好的TMB底物工作液（临用前按说明书比例混合TMB A 和 TMB B）。覆上封板膜。37°C 避光孵育 [15-30分钟，显蓝色明显即可]。

终止： 每孔加入 50 μL 终止液，轻轻晃动混匀（蓝色立刻变黄色）。

读值： 立即（30分钟内）用酶标仪在450nm波长下测量各孔的OD值。若仪器有参比波长（570nm或630nm）功能，启用该功能校正光学干扰。

结果计算

计算每对（或每三）复孔的平均OD450值（减去空白对照孔的平均值）。

以标准品的浓度为横坐标(X轴)，对应的平均OD450值为纵坐标(Y轴)，在普通坐标纸上或使用软件绘制标准曲线。推荐使用四参数回归 (4PL) 曲线拟合计算，效果**。

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