MAPK丝裂原活化蛋白激酶ELISA试剂盒操作步骤

标准品稀释与加样

取出冻干标准品，按照说明书要求加入标准品稀释液，静置10分钟充分溶解后，轻柔混匀。使用稀释液进行梯度稀释(建议设置7-8个浓度点)，每个浓度点需独立更换枪头以避免交叉污染。将稀释好的标准品及待测样本按设计顺序加入预包被板孔中(100μL/孔)，注意避免产生气泡。

孵育与洗涤

覆上封板膜，37℃恒温孵育90分钟。孵育结束后，弃去孔内液体，每孔加入350μL洗涤液，静置30秒后甩净，重复3次。最后一次洗涤后在吸水纸上拍干，避免残留液体影响显色。

酶标抗体反应

每孔加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，覆盖新封板膜，37℃避光孵育60分钟。重复步骤5的洗涤操作，确保未结合的抗体被彻底清除。

显色与终止

按1:1比例临时配制TMB显色液，每孔加入90μL，室温避光反应15-20分钟(若显色过快可缩短时间)。随后每孔加入50μL终止液，溶液颜色由蓝转黄，提示反应完成。

读数与数据分析

立即用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值(参考波长630nm)。以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，通过曲线方程计算样本中MAPK浓度。若样本OD值超出标准曲线范围，需用稀释液调整后重测。

注意事项

- 全程避免反复冻融试剂，标准品溶解后建议分装保存；

- 洗涤步骤需严格规范，残留洗涤液可能导致假阳性；

- 显色时间需根据室温灵活调整，过度显色会降低准确性；

- 建议设置复孔以减少操作误差，CV值应控制在15%以内。