抑制素A/Inhibinα重组兔单抗实验操作要点

一、样品准备

‌标本处理‌：

融化后保持2-8℃，加入PBS（pH7.4）匀浆，离心20分钟（2000-3000转/分），收集上清分装检测。

采集后尽快提取，若不能立即实验，可-20℃保存，避免反复冻融。

‌切片制备‌：

使用Winstar大鼠或ICR小鼠大脑皮质层冷冻切片。

用0.01M PBS洗涤3次，室温封闭缓冲液（含1.5%正常山羊血清和0.001M PBS的1%BSA）孵育2小时。

二、抗体孵育

‌一抗孵育‌：

4℃下，将样品与抗Iba1抗体（浓度0.5μg/mL）在封闭缓冲液中孵育过夜。

‌二抗孵育‌：

与生物素化的抗兔IgG抗体（浓度1:200）在封闭缓冲液中室温孵育1小时。

三、洗涤步骤

‌一抗后洗涤‌：

用0.01M PBS洗涤样品3次，去除未结合抗体。

‌二抗后洗涤‌：

再次用0.01M PBS洗涤样品3次，去除未结合二抗。

四、显色反应

‌ABC试剂孵育‌：

室温下与Elite ABC试剂（试剂A和B各稀释至1:50）孵育1小时。

‌最终洗涤‌：

用0.01M PBS进行最终洗涤。

五、注意事项

‌标本保存‌：

不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶（HRP）活性。

‌免疫程序‌：

初次免疫4-8周后，每隔2-3周加强免疫，每次加强免疫后7-10天采血。

末次注射后10天采耳静脉血，分离血清，若效价≥1:16即可放血。

‌无菌操作‌：

免疫家兔时注意无菌操作，以防感染。