测定原理:
NOX 能够将NADH 氧化为NAD,NADH 的氧化与2,6 二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP 被还原为无色的DCPIP,在600nm 下测定蓝色DCPIP 的还原速率计算出NADH 氧化酶活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、蒸馏水
试剂的组成和配制:
试剂一:液体50ml×1 瓶,-20°C保存。
试剂二:液体10ml×1 瓶,-20°C保存。
试剂三:液体1ml×1 瓶,-20°C保存。
试剂四:液体50ml×1 瓶,4°C保存。
试剂五:液体6 ml×1 瓶,4°C保存。
试剂六:粉剂×2 瓶,-20°C保存;临用前每瓶加入 5ml 蒸馏水,用不完的试剂分装后-20°C保存, 禁止反复冻融。
样本的前处理:
详见试剂盒内说明书关于样本处理的说明。测定组织、细菌和细胞时需要测定蛋白浓度。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min 以上,调节波长至600nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1) 试剂四、试剂五和试剂六于37°C(哺乳动物)或25°C(其它物种)孵育5min。
(2) 在1ml比色皿中加入40μL 样本、700μL 试剂四、100μL 试剂五和160μL 试剂六,混匀,记录600nm 处20s 时吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2,
计算:
ΔA=A1-A2