测定原理
羧酸酯酶能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固蓝显色,在450nm检测光吸收速率来监测萘酯 生成速率,从而计算CarE活性。
自备仪器用品
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器枪、1ml玻璃比色皿、无水乙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制(50T/48样): 未开封产品3个月内有效
试剂一:液体50ml×1 瓶,4°C保存
试剂二:液体30ml×2 瓶,4°C保存
试剂三:粉剂×2支,4°C保存,临用前取1支试剂三加1.2ml无水乙醇充分溶解
试剂四:粉剂×2支,-20°C保存
工作液配制:临用前取试剂二1瓶,取少量试剂二加入到1支试剂四中溶解,然后把溶解的1支试剂四和1支试剂三加入到该瓶试剂二中,混匀充分,过滤,4°C避光保存,可用1周。
样本前处理
样本提取详见试剂盒内说明书。测定细菌、组织和细胞时需要测定蛋白浓度。
测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上,调节波长到450nm,用蒸馏水调零。
2、工作液在37°C中预热30min 以上。
3、空白管:依次在1ml 玻璃比色皿中依次加入5μl蒸馏水,1000μl预热的工作液,迅速混匀后在450nm测定10s和190s光吸收A1 和A2,△A空白管=A2-A1。注意:空白管只需做1-2次。
4、测定管:依次在1ml 玻璃比色皿中依次加入5μl上清液,1000μl预热的工作液,迅速混匀后在450nm测定10s和190s光吸收A3 和A4,△A测定管=A4-A3。