γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。

γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通过测定405nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

工作液(在试剂一瓶中配制)：临用前配制，把试剂二倒入试剂一瓶中，充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解)；然后把试剂三倒入试剂一瓶中，混匀后室温保存。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；10000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.组织：称取约0.1g样本，加提取液1.0ml充分研磨，于4℃，10000rpm离心15min，取上清液待测。

3.血清(浆)：直接检测。

二、测定步驟

1.分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。

2.试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min以上(保证无沉淀)。

3.样本测定：

混匀后于405nm测定10s时的吸光度，吹打混匀后测量130s时的吸光度，记为A1和A2。计算ΔA测定管=A测2-A测1，ΔA空白管=A空2- A空1，计算ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。

三、γ-GT活性计算

1.按样本蛋白浓度计算：

活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×10⁶×V反总÷(Cpr×V样)÷T=0.506×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算：

活性单位定义：25℃或者37℃中，每克组织每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×10⁶×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=0.506×ΔA÷W

3.按血清(浆)体积计算：

活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫升血清每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×10⁶×V反总÷V样÷T=0.506×ΔA

4.按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT(U/10⁴cell)=ΔA÷(ε×d)×10⁶×V反总÷(500×V样÷V提取)÷T=0.001×ΔA

V样：加入样本体积，0.1ml；V提取：加入提取液体积：1ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500万细胞；ε：对硝基苯胺消光系数，9870L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；106：单位换算系数，1mol=106μmol。

注意事项：

培养细胞中γ-GT活性测定时，细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。