果糖-1,6-二磷酸(FDP)检测试剂盒(微量法)

果糖1,6-二磷酸(fructose-1,6-dipHospHate, FDP)是糖酵解过程中的一种重要的中间产物，对多种酶具有调节作用，具有改善细胞能量代谢、增加能量利用、抗心律失常及抗组织过氧化等作用，广泛应用于临床医药。

醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，产物与2,4-二硝基苯肼在酸性介质中反应生成2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈红棕色，在540nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入300μL蒸馏水，充分溶解后待用，用不完的试剂4℃保存，4℃保存一周；

2.标准品：临用前加入1176μL蒸馏水充分溶解，配制成50μmol/ml果糖-1,6-二磷酸标准溶液。

试验中所需的仪器和试剂:

可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤 (仅供参考) ：

一、样品处理理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：按照质量(g)：提取液一体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g，加入 1ml提取液一)加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃，12000g离心 10min，取 0.8ml上清液，再加入 0.16ml提取液二，4℃，12000g离心 10min后取上清待测。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液一体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液一)加入提取液一，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；于 4℃，12000g离心 10min，取 0.8ml上清液，再加入 0.16ml提取液二，4℃，12000g离心 10min后取上清待测。

3.血清(浆)：取 100μL血清(浆)加入 1ml提取液一，4℃，12000g离心 10min，取 0.8ml上清液，再加入 0.16ml提取液二，4℃，12000g离心 10min后取上清待测。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2.将 50μmol/ml的果糖-1,6-二磷酸标准液用蒸馏水倍比稀释为 3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1μmol/ml

的标准溶液备用。

3.样本测定：(在 1.5 ml离心管中操作)

三、FDA 含量计算

1.标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x轴，其对应的ΔA标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y= kx+b，将ΔA带入方程得到 x(μmol/ml)。

2.FDP含量的计算：

(1)按样本质量计算

FDP含量(μg/g质量)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=408x÷W

(2)按细胞数量计算

FDP含量(μg/10⁴cell)=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×细胞数量(万个)) =408x÷细胞数量(万个)

(3)按液体体积计算

FDP含量(μmol/ml)=x×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]=13.2x

V上清：提取时上清液体积，0.8ml；V提取液二：提取液二的体积，0.16ml；V提取液一：提取液一的体积，1ml；W：样本质量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子质量，340；V液体：液体样本体积，0.1ml。

注意事项：

1.当ΔA测定大于 0.5时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。