注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

XOD(EC 1.17.3.2)催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子，是活性氧主要来源之一；同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD主要分布于哺乳动物的心，肺，肝脏等组织中，当肝功能受损时，XOD大量释放到血清中，对肝损害的诊断具有特异性的意义。

XOD催化黄嘌呤产生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。

产品内容：

提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体30ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。或者直接用0.5mg/ml的酶液直接测定，为保证实验准确性建议用提取液梯度稀释后测定。

2、血清(浆)样品：直接检测。

二、测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。

2、XOD检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二中加入15ml试剂一，充分混匀，待用；用不完的试剂4℃可保存一周。

3、测定前按需取出一定量的XOD检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴30min以上。

4、空白管：在EP管中加入10μL水和250μL工作液，立即混匀并取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中，记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA空白＝A2-A1。

5、测定管：在EP管中加入10μL样本和250μL工作液，立即混匀并取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中，记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA测定＝A2-A1。

三、XOD活性计算：

1、血清(浆)XOD计算：

单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/ml)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷V样÷T=2.131×ΔA

2、组织、细菌或细胞中XOD计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/mg prot)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T =2.131×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/g鲜重)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T=2.131×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每万个细胞每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/10⁴cell)[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(V样÷V样总×500)÷T=4.262×10^-3×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500万。

1、血清(浆)XOD计算：

单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/ml)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷V样÷T=3.552×ΔA

2、组织、细菌或细胞中XOD计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/mg prot)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T =3.552×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/g鲜重)＝[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T =3.552×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每万个细胞每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/10⁴ cell)[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁶]÷(V样÷V样总×500)÷T=7.103×10^-3×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.6×10^-4L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×10⁴L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500万。

注意事项：

1、正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定，保证吸光值变化在0.01～0.9之间。

2、试剂二加入试剂一后会有部分小颗粒，可以直接使用或者离心后使用，对实验结果基本无影响。