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磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒(微量法)
磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装:100管/96样


产品介绍

PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一液体20ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×1瓶-20℃
试剂三液体25μL×1瓶-20℃
试剂四液体10μL×1瓶2-8℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加入17ml试剂一和1.13ml蒸馏水充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴5分钟,用不完的试剂-20℃分装保存一周;

2.试剂三:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为1:50的体积比例充分混匀,现用现配;用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存,避免反复冻融;

3.试剂四:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:125的体积比例充分混匀,现用现配。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本的前处理

1.细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)提取液体积(ml)为500-1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或者200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.组织:

按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3.血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.样本测定在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四和170μL试剂二,混匀,立即记

录340nm处20s时的吸光值A1,比色后迅速将比色皿或96孔板连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应10分钟;迅速取出比色皿并擦干,340nm下比色,记录10分20秒时的吸光度 A2,计算ΔA=A1-A2。

三、PFK 活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1.血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/ml)=[△A×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T=321×△A

2.组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(Cpr×V样)÷T=321×△A÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/g鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W×V样÷V样总)÷T=321×△A÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/104 cell)=[△A×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.642×△A

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下:

1.血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/ml)=[△A×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T=535×△A

2.组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(Cpr×V样)÷T=535×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W×V样÷V样总)÷T=535×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.07×ΔA

反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml; W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109,单位换算系数,1mol=109nmol。

注意事项:

1.测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置,以免变性和失活。

2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3.**两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

4.不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请坐1-2个预实验,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使 ΔA<0.5,以提高检测的灵敏度。

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