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磷脂酶A2(PLA2)检测试剂盒(微量法)
磷脂酶A2(PLA2)检测试剂盒(微量法)图片
包装:100管/48样


产品介绍

磷脂酶A2(EC3.1.1.4)是磷脂sn-2位脂酰基水解酶,广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中,参与脂肪消化,精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程,在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(HEPC)产生游离巯基,与DTNB反应生成黄色物质,在412nm处有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:


提取液:液体100ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体100ml×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体20ml×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体×5瓶,-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入1.8ml试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

所需的仪器和用品:

天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板

操作步骤:

一、样品处理:

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1ml提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清:直接测定。

二、测定步骤


对照管测定管
样品(μL)2020
试剂二(μL)180
试剂三(μL)0180
充分混匀,37℃反应10min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸馏水调零,测定412nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管

三、计算公式:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot)=A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=73.53×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/g鲜重)=△A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 73.53×△A÷W

3.细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/104cel1)=△A÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=73.53×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/ml)=△A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=73.53×△A

ε:TNB消光系数,13600L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V反总:反应总体积,Iml;V样:反应体系中加入样本体积,0.1ml; W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1ml; T:反应时间,10min

b.用96孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot)= AA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=147.06×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/g鲜重)= △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=147.06×△A÷W

3.细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/104cel1)=△A÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=147.06×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/ml)=△A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T= 147.06×△A

ε:TNB消光系数,13600L/mol/cm;d:比色皿光径,0.5cm; V反总:反应总体积,1ml;V样:反应体系中加入样本体积,0.1ml; W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1ml; T:反应时间,10min

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