| 包装 | 价格(元) |
| 50 rxns | 电议 |
| 100 rxns | 电议 |
HyperScript(TM) First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (with gDNA wiper)是基于HyperScript(TM) Reverse Transcriptase（货号：K1071）从Total RNA或Poly(A)+RNA合成第一链cDNA的试剂盒。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶，相较而言HyperScript(TM) Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度，适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，HyperScript(TM) Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录，可合成长达12.3 kb的第一链cDNA。
HyperScript(TM) First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (with gDNA wiper)包含合成第一链cDNA所需的除引物以外的所有组分，并提供Random Primers和Oligo (dT)23VN 两种cDNA合成引物。产品中包含的4 × gDNA wiper 可在逆转录前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰。可根据实验需要选择Random Primers、Oligo (dT)23VN或基因特异性引物作为逆转录引物，合成的第一链cDNA产物可用于后续的PCR扩增、qPCR反应等实验。
| 组分 | 50 rxns (20 μL reaction) | 100 rxns (20 μL reaction) |
| RNase Free ddH2O | 1 mL | 1 mL x 2 |
| 5X SuperMix | 200 μL | 400 μL |
| 4X gDNA wiper mix | 190 μL | 380 μL |
| Random Primers (50 μM) | 50 μL | 100 μL |
| Oligo (dT)23VN (50 μM) | 50 μL | 100 μL |
| 5X control Mix | 20 μL | 40 μL |
-20°C保存。 | ||
基于高效的HyperScript(TM) Reverse Transcriptase，适用于具有二级结构的RNA模板
合成第一链cDNA片段可长达12.3 kb
可检测低至1 pg的模板起始量
Kit中提供的Oligo (dT)23VN引物比Oligo (dT)18对模板锚定能力更强，逆转录效率更高
合成的第一链cDNA 可用于PCR 扩增、qPCR反应等实验
1）Q：收到产品后应怎么保存？
A：所有组分-20°C保存，有效期至少1年。
2）Q：能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率？
A：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升；但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率。
3）Q：原核生物RNA能否用该逆转录酶？
A：可以。因为原核生物的RNA没有poly A尾，在逆转录反应体系中需要选择Random primer作为逆转录引物。
4）Q：逆转录反应引物如何选择？
A：常用引物类型包括：随机引物、Oligo dT和基因特异性引物，选择情况如下：
a. 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。
b. Oligo dT：适用于具有Poly A尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA是不具有PolyA尾的）。由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
c. 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。
当cDNA后续是用于qPCR实验时，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性；当cDNA后续是用于PCR扩增长片段时，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物。因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因。
5）Q：可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗？
A：不可以。因为逆转录产物除了cDNA外，还有buffer、逆转录酶、引物、未转录的模板RNA等，这些都会干扰cDNA浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。
6）Q：逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带？
A：可能原因及解决方案如下：
a. 引物设计欠佳或逆转录产物质量欠佳：可先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR引物存在问题或逆转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解：哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0，如果比例小于2.0，则说明总RNA发生了显著的降解，需重新制备模板。
c. 模板RNA的纯度偏低：在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。
d. 逆转录模板量不足：在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。
e. 逆转录引物类型选择不当：对于细菌RNA和不含poly A尾的RNA，要用随机引物代替Oligo(dT)引物。使用基因特异性引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. RNA模板富含GC或容易形成二级结构：可考虑把反转录温度提高到45-55℃。
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