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HyperScript(TM)First-Strand cDNA Synthesis Kit
本产品不向个人销售,仅用作科学研究,不用于任何人体实验及非科研性质的动物实验。
HyperScript(TM)First-Strand cDNA Synthesis Kit图片
包装与价格:
包装价格(元)
20 rxn (20 uL/rxn)电议
50 rxn (20 uL/rxn)电议
100 rxn (20 uL/rxn)电议

产品介绍

描述

HyperScript(TM) First-Strand cDNA Synthesis Kit是基于HyperScript(TM) Reverse Transcriptase(货号:K1071)从Total RNA或Poly(A)+RNA合成第一链cDNA的试剂盒。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶,相较而言HyperScript(TM) Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。HyperScript(TM) Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外,HyperScript(TM) Reverse Transcriptase增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录,可合成长达12.3 kb的第一链cDNA。

HyperScript(TM) First-Strand cDNA Synthesis Kit包含合成第一链cDNA所需的所有组分,并提供Random Primers和Oligo (dT)23VN 两种cDNA合成引物。可根据实验需要选择Random Primers、Oligo (dT)23VN或基因特异性引物作为逆转录引物,合成的第一链cDNA产物可用于后续的PCR扩增、qPCR反应等实验。

组份和存储

组分20 rxn
(20 μL reaction)
50 rxn
(20 μL reaction)
100 rxn
(20 μL reaction)
HyperScript(TM) Reverse Transcriptase (200 U/μL)20 μL50 μL100 μL
5X First-Strand Buffer80 μL200 μL400 μL
RNase Inhibitor, Murine(40 U/μL)20 μL50 μL100 μL
10 mM dNTP Mixture20 μL50 μL100 μL
RNase Free ddH2O1 mL1 mL1 mL x 2
Random Primers (50 μM)20 μL50 μL100 μL
Oligo (dT)23VN (50 μM)20 μL50 μL100 μL

所有组分储存于-20°C。

特性

基于高效的HyperScript(TM) Reverse Transcriptase,适用于具有二级结构的RNA 模板

合成第一链cDNA片段可长达12.3 kb

可检测低至1 pg的模板起始量

Kit中提供的Oligo (dT)23VN引物比Oligo (dT)18对模板锚定能力更强,逆转录效率更高

合成的第一链cDNA 可用于PCR 扩增、qPCR 反应等实验

常见问题解答

1)Q:收到产品后应怎么保存?

A:所有组分-20°C保存,有效期至少1年。

2)Q:能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率?

A:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升;但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。

3)Q:原核生物RNA能否用该逆转录酶?

A:可以。因为原核生物的RNA没有poly A尾,在逆转录反应体系中需要选择Random primer作为逆转录引物。

4)Q:逆转录反应引物如何选择?

A:常用引物类型包括:随机引物、Oligo dT和基因特异性引物,选择情况如下:

a. 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

b. Oligo dT:适用于具有Poly A尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA是不具有PolyA尾的)。由于Oligo dT结合在PolyA尾上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

c. 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因逆转录。

当cDNA后续是用于qPCR实验时,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性;当cDNA后续是用于PCR扩增长片段时,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物。因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,可能会对长片段扩增造成稀释,后续扩增不出全长的目的基因。

5)Q:可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗?

A:可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗?

6)Q:逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带?

A:可能原因及解决方案如下:

a. 引物设计欠佳或逆转录产物质量欠佳:可先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR引物存在问题或逆转录产物质量欠佳。

b. 模板RNA发生了降解:哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0,如果比例小于2.0,则说明总RNA发生了显著的降解,需重新制备模板。

c. 模板RNA的纯度偏低:在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。

d. 逆转录模板量不足:在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。

e. 逆转录引物类型选择不当:对于细菌RNA和不含poly A尾的RNA,要用随机引物代替Oligo(dT)引物。使用基因特异性引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。

f. RNA模板富含GC或容易形成二级结构:可考虑把反转录温度提高到45-55℃。