| 包装: | 25 rxns |
| 市场价: | 3600元 |
HyperScribe(TM) T7 High Yield Cy3 RNA Labeling Kit旨在通过体外转录随机产生Cy3修饰的RNA探针。此类探针非常适合原位杂交和Northern印记杂交实验。其标记原理与Cy3 标记RNA混合物的基本标记原理相似。使用优化的反应缓冲液和T7 RNA聚合酶混合物，将Cy3-UTP有效地掺入RNA中，以替代其天然对应物UTP。合适的Cy3-UTP取代通常可在反应和标记效率之间实现最佳平衡。但是，用单一核苷酸的形式可以轻松实现Cy3-UTP / UTP比值的单独优化。随后可以通过荧光光谱法检测所得的Cy3修饰的RNA探针。
| 组分 | 25 rxns |
| T7 RNA Polymerase Mix | 50 μL |
| 10X Reaction Buffer | 50 μL |
| ATP (20 mM) | 50 μL |
| GTP (20 mM) | 50 μL |
| UTP (20 mM) | 37.5 μL |
| CTP (20 mM) | 50 μL |
| Cy3-UTP(10mM) | 25 μL |
| Control Template(0.5 μg/μL) | 5 μL |
| RNase-free H2O | 1 mL |
所有的组分请在-20℃保存。 | |
1) RNA产物片段大于预期。
如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；② 有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。
建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2) RNA产物片段小于预期。
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板序列中包含类似于T7 RNA 聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高形成高级结构；③RNase污染。
不同的聚合酶识别不同的终止序列，若含是模板中含终止结构，建议尝试不同的RNA 聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物 。
3) 产物电泳拖尾现象。
电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNA酶污染；②DNA模板被 RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留，建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase- free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4) 模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？
模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。
5) 模板一定要是双链吗？
至少T7启动子要是双链的。
6) 合成的RNA如何纯化？是否有配套的过柱纯化盒子？
可使用RNA Clean and Concentrator Kit(K1069)进行RNA纯化。
7) 使用线性化的质粒时，线性化质粒的方法有哪些？
酶切（注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点）、反向PCR（得到的就 是PCR产物）。
8) 使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’ 突出末端的限制性内切酶进行线性化？
原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生 成的产物片段大小不一。
9) sgRNA条带模糊。
sgRNA是100nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会 发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10) 体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？
最小做过21bp的siRNA，最大做过10kb。
11) 针对大片段和小片段，转录的效率如何？
大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的 产物条带就不是那么集中，其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反 应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所 以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2μg。
12) 模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？
提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13) 模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量 ？
降低反应温度。
14) 产物纯化方式比较。
酚/氯仿抽提的优点是便宜，但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游 离的核苷酸去除干净，但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高， 可达到90%以上。
15) 得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。
(1) 产物长度小于300nt时，建议提高产物的投入量至2μg，适当延长反应时间。
(2) 阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在
1) RNA产物片段大于预期。
如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；② 有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。
建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2) RNA产物片段小于预期。
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板序列中包含类似于T7 RNA 聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高形成高级结构；③RNase污染。
不同的聚合酶识别不同的终止序列，若含是模板中含终止结构，建议尝试不同的RNA 聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物 。
3) 产物电泳拖尾现象。
电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNA酶污染；②DNA模板被 RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留，建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase- free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4) 模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？
模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。
5) 模板一定要是双链吗？
至少T7启动子要是双链的。
6) 合成的RNA如何纯化？是否有配套的过柱纯化盒子？
可使用RNA Clean and Concentrator Kit(K1069)进行RNA纯化。
7) 使用线性化的质粒时，线性化质粒的方法有哪些？
酶切（注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点）、反向PCR（得到的就 是PCR产物）。
8) 使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’ 突出末端的限制性内切酶进行线性化？
原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生 成的产物片段大小不一。
9) sgRNA条带模糊。
sgRNA是100nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会 发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10) 体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？
最小做过21bp的siRNA，最大做过10kb。
11) 针对大片段和小片段，转录的效率如何？
大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的 产物条带就不是那么集中，其他竞品公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反 应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所 以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2μg。
12) 模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？
提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13) 模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量 ？
降低反应温度。
14) 产物纯化方式比较。
酚/氯仿抽提的优点是便宜，但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游 离的核苷酸去除干净，但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高， 可达到90%以上。
15) 得到的产物量无法达到说明书说的100-150ug可能的原因及建议。
(1) 产物长度小于300nt时，建议提高产物的投入量至2μg，适当延长反应时间。
(2) 阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在1.9kb左右，对于阳性对照的实验设 计可以在选择反应2h后从20μL的体系中取出5-10μL确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确 定产量。
(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16) 可以用于合成mRNA吗？
可以，但是要自己购买帽子类似物，说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体 系，里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。
17) 模板投入量增加为2μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？
模板投入量增加为2μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶 的量从1μL提高至3μL。
18) 对照组投入0.5μg产出是多少？
Control Template的长度约500bp，投入0.5μg，产出约150-200μg，最低130μg（ 转录后直接用Qubit测量浓度）
左右，对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2h后从20μL的体系 中取出5-10μL确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16) 可以用于合成mRNA吗？
可以，但是要自己购买帽子类似物，说明书中提供的加帽RNA体系就是合成mRNA的体 系，里面GTP和加帽类似物的浓度比例建议为1:4。
17) 模板投入量增加为2μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？
模板投入量增加为2μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶 的量从1μL提高至3μL。
18) 对照组投入0.5μg产出是多少？
Control Template的长度约500bp，投入0.5μg，产出约150-200μg，最低130μg（ 转录后直接用Qubit测量浓度）
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