激酶实验

测定缓冲液含有50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1mg/ml BSA、5mM DTT、pH 7.8。对于HTS，将0.8μL 5 mM溶解在DMSO中的测试化合物点在384孔板上。为了测量IC50，通过3倍和11点连续稀释制备化合物板。将0.8 μL的DMSO中的化合物从化合物板转移到测定板。在测定缓冲液中制备8 nM未磷酸化的c-Met或0.5 nM磷酸化c-Met的溶液。将溶解在DMSO中的1 mM的肽底物生物素EQEDEPEGDYFEWLE酰胺的1 mM储备液在含有400 μM ATP（未磷酸化c-Met）或160 μM ATP（磷酸化c-Met）的测定缓冲液中稀释至1 μM。将20 μL体积的酶溶液加入每个板中的适当孔中，然后每孔加入20 μL的底物溶液以引发反应。保护板免受光照，并在25℃温育90分钟。通过加入20 μL含有45 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.4 mg/ml BSA、200 nM SA-APC和3 nM EU-Py20的溶液来终止反应。将板在室温下孵育15-30分钟，并在Perkin Elmer Fusionα-FP仪器上测量HTRF（均匀时间分辨荧光）。

细胞系

人肿瘤细胞系(SNU-5、SNU-1、U-87MG、786-O、A549、H441、H596、H1437、H1993、BT474、A549和HT-29), MKN-45细胞系，S114细胞系，来自于健康人群和癌症患者的血液样本

溶解方法

在DMSO中的溶解度有限。若获取更高浓度的溶液，可在37℃下孵育10分钟，随后在超声波浴中摇匀。-20℃以下可储存数月。

反应条件

IC50: 0.13 nM (c-MET)，72小时

应用

在SNU-5人胃癌细胞系中，INCB28060（IC50：1nM）抑制人c-MET磷酸化和c-MET介导的信号转导。INCB28060抑制SNU-5的活力或增殖，平均IC50值为1.2 nM。INCB28060（2 nM）阻止HGF刺激的H441细胞迁移。在c-MET依赖性肿瘤模型中，INCB28060表现出很强的抗肿瘤活性。INCB28060显示皮摩尔浓度的酶效力，对c-MET具有高度特异性，跟人类其它激酶相比具有超过10,000倍的选择性。INCB28060（24小时）有效抑制c-MET依赖性肿瘤细胞增殖和迁移，有效诱导细胞凋亡。

动物模型

皮下注射S114肿瘤细胞或U-87MG胶质母细胞瘤肿瘤细胞雌性Balb/c nu/nu小鼠（Charles River）

给药剂量

0.03、0.1、0.3、1、3或10 mg/kg

应用

在c-MET驱动的小鼠肿瘤模型中，口服给药INCB28060以时间和剂量依赖性方式抑制c-MET磷酸化和肿瘤生长。在实现完全肿瘤抑制的剂量下，INCB28060具有良好的耐受性。在10只U-87MG荷瘤小鼠中，每日给药10 mg/kg INCB28060导致6只小鼠的肿瘤部分消退。

注意事项

由于实验环境的不同，实际溶解度可能与理论值略有不同，请测试室内所有化合物的溶解度。

References:

[1]. Behshad E, Klabe R M, Margulis A, et al. Phosphorylation state-dependent high throughput screening of the c-MET kinase[J]. Current chemical genomics, 2010, 4: 27.

[2]. Liu X, Wang Q, Yang G, et al. A novel kinase inhibitor INCB28060 blocks c-MET-dependent signaling, neoplastic activities, and crosstalk with EGFR and HER-3[J]. Clinical Cancer Research, 2011: clincanres. 1157.2011.