测定原理:
NADK催化NAD+磷酸化,生成 NADP+,NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH;通过在340nm下测定NADPH的增加速率可反映出NADK活性的大小。
自备实验用品及仪器:
水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 ml 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 50ml×1 瓶,4°C 保存;
试剂一:溶剂 25ml×1 瓶,4°C 保存;
试剂二:溶剂 50ml×1 支,4°C 保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20°C 保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20°C 保存。
样品前处理:
详见试剂盒内说明书关于样本处理的说明。测定组织、细菌和细胞时需要测定蛋白浓度。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零;
2、将溶剂一与溶剂二在 37°C(哺乳动物)或 25°C(其他物种)水浴 15min 以上;
3、工作液 I 的配制:在试剂三中加入 12ml 溶剂一,充分混匀待用;现配现用;
工作液 II 的配制:在试剂四中加入 45ml 溶剂二,充分混匀待用,现配现用。
4、操作表
试剂(μl) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
工作液一 | 400 |
|
试剂一 |
| 400 |
充分混匀,在 37°C(哺乳动物)或 25°C(其他物种)水浴 15min,
立即煮沸 2min(盖紧以防水分流失),并与冷却,1000g,室温离心 10min,取上清
加完试剂混匀后,室温静置 15 分钟在 340nm 下测定 30 秒的吸光值,计算ΔA=A 测定-A 对照。