AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定 680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

提取液：液体35ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10ml蒸馏水溶解。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10ml提取液，沸水浴中磁力搅拌溶解。

试剂三：液体50ml×1瓶， 4℃保存。

试剂四：液体10ml×1瓶，4℃保存。

标准品：液体1ml×1支，20μmol/ml标准酪氨酸溶液，4℃保存。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mlEP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约0.1g组织，加入1ml提取液，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品，加入1ml提取液，置冰上待测。

二、测定：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。

2、试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。

3、标准溶液的配制：临用前将20μmol/ml标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/ml标准溶液使用，现用现配。

4、样本测定(在1.5mlEP管中依次加入下列试剂)

取1ml于1ml玻璃比色皿中，于680nm测定光吸收，分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。并计算ΔA测定=A测定管-A对照管、ΔA标准=A标准管-A空白管。

三、碱性蛋白酶活性计算：

(1)按蛋白浓度计算

酶活单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

AKP活性(U/mg prot)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V₁÷(Cpr×V₂)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活单位定义：40℃每克样本每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

AKP活性(U/g质量)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V₁÷(W×V₂÷V₃)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

C标准品：0.25μmol/ml标准酪氨酸溶液； Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/ml)；W：样品质量(g)；V₁：酶促反应总体积(ml)，0.5ml；V₂：加入反应体系中粗酶液体积(ml)，0.1ml；V₃：粗酶液总体积(ml)，1ml；T：催化反应时间(min)，10min。

注意事项：

若反应较弱，(A测定管－A对照管)差值较小，可适当延长反应时间(20-30min)，即**步水浴时间，最后计算酶活时对公式进行修改。