土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。土壤碱性蛋白酶在碱性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。碱性条件下，土壤碱性蛋白酶可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝，在680nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入10ml试剂一，沸水浴搅拌溶解后待用；

2.试剂三：临用前加入10ml蒸馏水充分溶解待用；

3.标准品：20μmol/ml酪氨酸溶液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、研钵、蒸馏水、30-50目筛。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可参考文献)

新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30～50目筛。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。

2.标准溶液的稀释：将20μmol/ml酪氨酸标准液用蒸馏水稀释100倍至0.2μmol/ml使用，现用现配。

3.样本测定：

三、土壤碱性蛋白酶活性计算

单位定义：每天每 g土样中产生 1μmol的酪氨酸为一个土壤碱性蛋白酶活力单位。

土壤碱性蛋白酶(U/g土样)=C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V反总÷W÷T=0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W

C标准：标准管浓度，0.2μmol/ml；V反总：反应体系总体积，0.25ml；T：反应时间，1d；W：样本质量，g。

注意事项：

当吸光值大于 1.5时，建议将上清液用蒸馏水稀释后进行测定，计算时注意乘以稀释倍数。

实验实例：

1.分别取 0.05g三叶草土于 1.5mlEP管中，分别为对照管及测定管，按照测定步骤操作，用 96孔板测得ΔA测定=A测定-A对照=0.234-0.180=0.054，ΔA标准=A标准-A空白=0.374-0.045=0.329，按土壤质量计算酶活得：土壤碱性蛋白酶(U/g土样)=0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W=0.05×0.054÷0.329÷0.05=0.1641U/g土样。

2.分别取 0.05g森林 10号土样于 1.5mlEP管中，分别为对照管及测定管，按照测定步骤操作，用 96孔板测得 ΔA测定=A测定-A对照=0.829-0.566=0.263，ΔA标准=A标准-A空白=0.374-0.045=0.329，按土壤质量计算酶活得：土壤碱性蛋白酶(U/g土样)=0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W=0.05×0.263÷0.329÷0.05=0.7994U/g土样。

相关发表文献：

[1] Manyun Zhang,Jun Wang, Shahla Hosseini Bai,et al. Evaluating  the effects of pHytoremediation with biochar additions  on soil nitrogen mineralization  enzymes  and fungi. Environmental  Science and Pollution  Research.  May 2018；(IF₂.914)

[2] Zhang M,  Wang W, Wang J,  et  al.  Dynamics of biochemical  properties  associated  with  soil nitrogen mineralization  following nitrification  inhibitor  and fungicide applications[J].  Environmental  Science and Pollution Research, 2017, 24(12): 11340-11348.