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酪氨酸酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)
酪氨酸酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)图片
产品介绍

酪氨酸酶(tyrosinase:EC 1.14.18.1)是一种单酚单加氧酶,是具有双功能的含铜糖蛋白,广泛存在于植物、酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,也是引起果蔬酶促褐变的主要因素,同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响。

酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素,其在475nm下有特征吸收峰,进而测定出酪氨酸酶的活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一粉剂×3瓶2-8℃

溶液的配制:

1.试剂一:临用前每瓶加入15ml提取液充分溶解待用,现配现用。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:称取约0.1g组织,加入1ml提取液进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2.细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每500万细胞或细菌加入1ml提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次)。12000g,4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

3.血清(浆):直接检测。

二、测定操作

1.分光光度计预热30min,波长调至475nm。蒸馏水调零。

2.加样表(在1ml玻璃比色皿中分别加入)

试剂名称(μL)测定管
试剂一900
样本100

充分混匀后立即测定10s时在475nm下的吸光度,记为A1,之后迅速将其放入37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴或培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度,记为A2。计算ΔA=A2-A1。

三、酪氨酸酶酶活计算

1.按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(W÷V提取×V样)÷T=90.09×ΔA÷W

3.按细胞或细菌数量计算:

单位的定义:每104个细胞或细菌每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(500÷V提取×V样)÷T=0.18×ΔA

4.按血清(浆)体积计算:

单位的定义:每ml血清(浆)每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T=90.09×ΔA

V反总:反应总体积,10-3L;ε:多巴色素的摩尔消光系数:3.7×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;109:单位换算系数,1mol=109nmol;V样:加入的样本体积,0.1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量, g;V提取:提取液体积,1ml;500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,3min。

注意事项:

1.当ΔA大于0.3时,建议将样本用提取液稀释后测量;ΔA过小时,建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增加加入的样本体积来测定。

2.试剂一溶解后易氧化。溶解后尽快用完。

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