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磷脂酶C(PLC)检测试剂盒(微量法)
磷脂酶C(PLC)检测试剂盒(微量法)图片
包装:100管/96样


产品介绍

磷脂酶C(EC 3.1.4.3)是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶,广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中,在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。

磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚,在410nm处有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一液体102ml×1瓶2-8℃
试剂二液体10ml×1瓶2-8℃,避光
试剂三液体8ml×1瓶2-8℃

需自备的仪器和用品:

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

操作步骤:

一、酶液提取

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约01g,加入1ml提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞:按照细胞数量(104个);提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清:直接测定。

二、测定操作

试剂名称(μL)空白管测定管
样品
20
试剂一20
试剂二100100
充分混匀,37℃反应30min
试剂三8080
充分混匀,于微量石英比色皿/96孔板,蒸馏水调零,测定410nm处吸光值,分别记为A空白管和A测定管,△A=A测定管-A空白管。

三、酶活计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.0191x-0.0103,R2=0.9991

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样×Cpr)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解NPPC产生lnmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/g鲜重)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷W

3.按照细胸数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/104cell)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=17.45×(△A+0.0103)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/ml)=(△A+0.0103)÷0.0191×V反总÷V样÷T=17.45×(△A+0.0103)

V反总:反应总体积,0.2ml;V样:加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,30min

b.96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y=0.0095x-0.0103,R2=0.9991

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷(V样×Cpr)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/g鲜重)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/104cell)=(△A+0.0103)-0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=35.09×(△A+0.0103)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC活性(nmol/min/ml)=(△A+0.0103)÷0.0095×V反总÷V样÷T=35.09×(△A+0.0103)

V反总:反应总体积,0.2ml;V样:加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,30min。

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