测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。
仪器设备(自备):
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成:(50T/24 样)
酸性提取液:50ml×1 瓶,4°C保存;
碱性提取液:50ml×1 瓶,4°C保存;
试剂一:液体15 ml×1 瓶,4°C保存;
试剂二:粉剂×1 支,-20 °C保存,用时加入4ml 蒸馏水,混匀;用不完的试剂4°C保存一周;
试剂三:粉剂×1 支,-20°C保存,用时加入4ml 蒸馏水,混匀;用不完的试剂4°C保存一周;
试剂四:粉剂×1 支,4 °C保存,用时加入4ml 蒸馏水,混匀;用不完的试剂4°C保存一周;
试剂五:液体1.8ml×1 支,4 °C保存;
试剂六:液体30ml×1 瓶,4 °C保存;
试剂七:液体50ml×1 瓶,4 °C保存。
操作步骤:
(一)NADP+和NADPH 的提取:
详见试剂盒内说明书关于样本处理的说明。
(二)测定步骤: (在1.5ml 棕色EP管中按下表依次加样,反应过程需要避光):
试剂名称(μl) | 对照管 | 测定管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 250 | 250 |
试剂二 | 75 | 75 |
试剂三 | 75 | 75 |
试剂四 | 75 | 75 |
试剂五 | 35 | 35 |
试剂六 | 500 | 混匀,室温避光静置20min |
试剂六 |
| 500 |
充分混匀,静置5min后,20000g,25°C离心5min,弃上清,沉淀中加入:
混匀,波长570nm,光径1cm,双蒸水调零测定对照吸光值A1和测定管吸光
值A2,计算△A=A2-A1。
注:对照管试剂五加完后必须马上加入试剂六,而测定管加完试剂五之后必须反应20min后再加试剂六。