HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的**个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADpH，NADpH在340nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入18ml试剂一充分溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min；用不完的试剂4℃保存一周；

2.试剂三：临用前取1支加入0.5 ml试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。

自备材料：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰。

操作步骤 (仅供参考) ：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清(浆)样本：直接检测。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.在微量石英比色皿或96孔板中加入180μL试剂二、10μL试剂三和10μL样本，混匀，立即记录340nm处20秒时的吸光值A1，比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴或恒温箱中，准确反应5分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1。

三、HK活性计算

A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.血清(浆)HK活性单位的定义：每毫升血清(浆)在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=643×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活性

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。 HK(U/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADpH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

B、用96孔板测定的计算公式如下

1.血清(浆)HK活性单位的定义：每毫升血清(浆)在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=1071.7×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活性

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1071.7×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=1071.7×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。 HK(U/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.143×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADpH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm； V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3.不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请做1-2次预试验，若ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数)，或缩短反应时间至2min，使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。